T-2毒素是由多种镰刀菌（主要是拟枝孢镰刀菌）产生的次级代谢产物。近年来,T-2毒素的神经毒性受到研究人员特别关注。体内动物试验研究表明,T-2毒素的暴露使小鼠或大鼠出现包括肌无力、共济失调和厌食在内的神经系统症状,甚至在大脑中枢神经系统血管周围出现显著水肿等明显脑损伤现象。此外,T-2毒素的暴露增加血脑屏障（BBB）通透性,使得甘露醇和伊文思蓝等可以跨越BBB。体外细胞模型研究发现,T-2毒素可以在神经侧累积,表明T-2毒素可能跨越BBB而损伤大脑和垂体等器官。然而,T-2毒素是否可以直接进入大脑而损伤脑部组织器官尚不清楚。PGC-1α是一种有效的线粒体生物合成和呼吸作用的激活剂,能够调控多种ROS代谢解毒酶（SOD-1、SOD-2、GPX-1、CAT）和线粒体UCP-2的表达,降低细胞内的ROS水平和氧化应激损伤。此外,PGC-1α与脑部损伤密切相关,在多种疾病引起的BBB损伤中起保护作用。因此,保持和增加PGC-1α水平是改善由其他疾病或外界刺激等造成的脑部损伤,尤其是BBB损伤及BBB通透性改变的重要手段。本实验室前期基因组结果显示,T-2毒素孵育GH3细胞可提高细胞内PGC-1α的基因表达水平。然而,PGC-1α是否可以作为靶点减轻T-2毒素的脑损伤毒性作用尚待进一步研究。因此,本研究以T-2毒素诱导的神经毒性为切入点,研究T-2毒素在体内是否可以直接跨越BBB及PGC-1α在T-2毒素引起的脑部损伤中的作用,并以PGC-1α为靶点筛选拮抗T-2毒素毒性的小分子化合物并进行体内外验证。此外,研究小分子化合物对其他有毒有害物质引起的BBB损伤是否也具有保护作用,为开发小分子化合物作为缓解BBB损伤的药物奠定基础。1 T-2毒素进入大鼠大脑引起大鼠大脑自噬和垂体凋亡本研究采用LC-MS/MS的方法检测到实验组大鼠脑部T-2毒素的含量为0.012μg/m L。T-2毒素对大脑的损伤作用随着暴露时间的增加而减弱,表现为T-2毒素暴露后3天大脑实质明显出血,7天后出血情况有所改善;T-2毒素暴露1天后,大脑皮层线粒体出现肿胀、空泡、嵴脱落、膜结构受损等损伤,暴露7天后,大多数线粒体的结构已经恢复正常。基因和蛋白表达结果显示,T-2毒素可以显著增加脑部自噬相关基因LC3、atg5和m TOR的基因表达,并增加LC3的蛋白表达,显著降低caspase-3和Bcl-x的基因表达,caspase-9和bax表达水平无明显变化。T-2毒素对垂体的损伤作用随着暴露时间的增加而增加,T-2毒素处理后,大鼠垂体前叶充血,且在T-2毒素处理7天后,充血最明显,细胞核深染,表明垂体细胞可能已发生凋亡;T-2毒素暴露1天后,部分线粒体开始肿胀;3天后,线粒体出现肿胀、空泡、嵴脱落、膜结构受损的现象;7天后,线粒体嵴排列无序,且线粒体区变成了电子透明区。垂体组织中LC3和atg5的基因表达仅在特定时间增加表达,LC3蛋白表达无明显变化,bax、Bcl-x和caspase-3表达水平显著升高,结果表明T-2毒素可抑制大鼠脑皮层细胞凋亡,引起大鼠垂体细胞凋亡。综合分析凋亡和自噬的关系,表明T-2毒素对垂体的损伤大于其对大脑皮层的损伤作用,且T-2毒素能直接进入大脑而对脑部造成损伤作用。2 PGC-1α是GH3细胞抵抗T-2毒素引起的氧化应激的重要因子本研究采用LC-MS/MS的方法检测了GH3细胞内外T-2毒素的含量。10 n M（4.66μg/kg）和40 n M（18.66μg/kg）的T-2毒素进入GH3细胞的含量达到了7.37%和11.82%,即0.34±0.09μg/kg和2.09±0.13μg/kg,说明T-2毒素可以直接进入GH3细胞,且随着T-2毒素浓度的升高,进入细胞的T-2毒素浓度和比例增加,表明随着T-2毒素浓度的升高,可能带来更大的细胞毒性。10和40 n M的T-2毒素孵育24 h,对GH3细胞氧化应激水平进行检测,包括检测细胞ROS水平,抗氧化应激酶SOD和GSH-Px的活性,及线粒体相关抗氧化应激基因PGC-1α和Tfam的表达水平。结果显示,T-2毒素剂量依赖性增加GH3细胞ROS水平、抗氧化酶活性及PGC-1α和Tfam的表达。随后,在GH3细胞中分别沉默PGC-1α和Tfam,结果显示,GH3细胞中沉默PGC-1α的表达能显著降低抗氧化酶的活力,并抑制Tfam的表达。然而,T-2毒素加入后,氧化酶的活力会代偿性的增加。GH3细胞中沉默Tfam的表达能显著降低抗氧化酶的活力,并增加ROS的水平。上述结果说明,PGC-1α通过正调控Tfam的表达而发挥抗氧化应激的作用,提示PGC-1α是GH3细胞抵抗氧化应激的一个重要因子。3 PGC-1α是h BMEC细胞抵抗T-2毒素细胞紧密性损伤的重要基因CCK-8试验结果显示,随着T-2毒素孵育浓度的增加,h BMEC细胞的活力随剂量依赖性降低。体外构建BBB模型结果显示,T-2毒素显著降低h BMEC细胞的TEER,并增加Na F渗透系数,表明T-2毒素破坏了BBB的紧密性。此外,T-2毒素剂量依赖性增加PGC-1α、SOD、GSH-Px、IL1β、TNFα、IL6、CCL2、CLCX1和CCL3基因表达。T-2毒素剂量依赖性下调TJs（ZO-1、CLDN5和occuldin）基因和蛋白表达。上述试验结果表明T-2毒素可引起h BMEC细胞的毒性并通过降低TJs的表达而引起BBB损伤。本研究应用过表达或抑制PGC-1α的表达结合间接免疫荧光技术进一步研究PGC-1α对TJs的影响。h BMEC细胞中过表达PGC-1α能显著增加细胞膜处TJs（ZO-1、CLDN5和occludin）的荧光强度,并改善T-2毒素引起的细胞膜模糊的现象。然而,PGC-1α的抑制剂SR-18292则进一步加重T-2毒素引起的TJs表达降低,细胞间的TJs更加模糊不清甚至失去细胞间TJs。结果表明PGC-1α是h BMEC细胞抵抗T-2毒素引起的BBB损伤的重要保护因子。4中药小分子化合物激活PGC-1α而抵抗T-2毒素和LPS引起的BBB损伤双荧光素酶结合分子对接技术从166份中药小分子化合物中筛选到化合物3-131直接与人PGC-1α的启动子结合并激活PGC-1α的转录,点突变试验对结合位点进行验证,发现71-73位（-1100 bp～-1000 bp）碱基突变后,双荧光素酶活性较P7降低了70%,提示3-131与PGC-1α转录起始位点上游-1100 bp～-1000 bp（71-73位碱基）直接以氢键结合而激活PGC-1α的转活性。采用T-2毒素和LPS构建体内体外BBB损伤模型,检测细胞和动物水平Na F的渗透情况及体内外TJs的表达情况来综合分析小分子化合物3-131对BBB的保护作用。体外BBB模型结果显示,T-2毒素和LPS可以显著降低TEER,增加Na F通透性,降低TJs（ZO-1、CLDN5和occludin）的表达,加入3-131后可以增加细胞间的TJs,使细胞膜结构清晰,缓解T-2毒素或LPS带来的BBB损伤。体内动物试验模型结果显示,T-2毒素和LPS引起小鼠脑内Na F增加;脑组织结构异常,大量海马区神经元出现变性且排列出现疏松紊乱现象,胞体固缩深染,并可见纤维缠结;ZO-1、CLDN5和occludin的蛋白表达降低,IL1β和TNFα蛋白表达增加。3-131可以增加小鼠血脑屏障紧密性、减轻大脑病理损伤、缓解大脑炎症反应从而缓解T-2毒素或LPS带来的脑损伤。综上所述,本文研究了T-2毒素直接跨越BBB对脑和垂体造成的损伤作用、PGC-1α在T-2毒素引起的垂体细胞氧化应激中的作用、PGC-1α在T-2毒素引起的BBB损伤中的作用、基于PGC-1α为靶点的小分子拮抗剂筛选及小分子拮抗剂在T-2毒素和LPS外界有毒有害物质损伤BBB中的保护作用。本文从神经毒性角度出发,以PGC-1α为靶点、以BBB损伤为研究对象,为T-2毒素引起的垂体和脑部损伤提供了新的依据,为研究T-2毒素拮抗剂提供了新的研究方向,同时为研究BBB保护剂奠定了基础。