三七总皂甙对马兜铃酸Ⅰ诱导肾小管上皮细胞转分化的影响及机制研究

来源 :泸州医学院 西南医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zzdlily_6000
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目的:马兜铃酸肾病是由于服用含有马兜铃酸(aristolochic acid,AA)的中草药所致。其主要机制是直接损害肾小管上皮细胞,使其发生转分化、坏死或凋亡,进而导致肾间质纤维化。肾小管间质纤维化是各种慢性、进展性肾脏疾病发展为终末期肾功能衰竭的共同通路,其主要病理改变为肾小管上皮细胞减少、细胞外基质积聚和一定阶段内间质中出现较多的肌成纤维细胞。研究表明,肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(tubular epithelial-myofibriblast transdifferentiation,TEMT)可能是马兜铃酸所致肾间质纤维化的主要原因;转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是致肾间质纤维化的主要细胞因子;马兜铃酸诱导的肾小管上皮细胞转分化与TGF-β1有关,但对其下游作用机制尚不十分清楚。三七总皂甙(total saponins of panax notoginseng,PNS)是三七的主要成分,可通过多种机制防治肝和肾纤维化的发展。 本研究拟通过建立马兜铃酸诱导肾小管上皮细胞转分化的体外模型,探讨马兜铃酸诱导肾小管上皮细胞转分化过程中对TGF-β1及其下游介质结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响,以及PNS是否能抑制马兜铃酸诱导的肾小管上皮细胞转分化及其作用机制,为临床应用PNS治疗慢性马兜铃酸肾病提供新的实验依据。 方法:将HK-2细胞与不同浓度(0,10,20,40,60,80μg/ml)的AA Ⅰ共同培养48h后,用MTT法检测细胞的增殖活性;免疫组织化学方法测定肌成纤维细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达。在建立AA Ⅰ诱导体外培养肾小管上皮细胞转分化模型的基础上,将HK-2细胞分为6个组,分别为空白对照组、PNS对照组、AA Ⅰ诱导组、不同剂量(200,400,600μg/ml)PNS治疗组。每组分别培养至24 h、48 h、72 h时,应用倒置相差显微镜观察细胞形态;免疫组织化学方法检测α-SMA的表达;EUSA法测定培养细胞上清液中TGF-β1的含量;RT-PCR法检测CTGFmRNA表达。 结果: 1.HK-2细胞与AA Ⅰ共培养48 h后,与对照组比较40、60、80 μg/ml AA Ⅰ组OD值减小(P<0.05);AA Ⅰ诱导组细胞表达α-SMA随AA Ⅰ的浓度增加而增加,60、80 μg/ml AA Ⅰ组细胞大量表达α-SMA,但有部分细胞坏死、脱落。 2.与空白对照组比较, AA Ⅰ诱导组细胞培养48 h、72 h后从原有典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态;免疫组织化学染色见胞浆内大量表达α-SMA,其积分光密度值增加,差异具有显著性(P<0.05):CTGFmRNA表达相对量较同期对照组增加(P<0.05); AA Ⅰ诱导组细胞培养24 h、48 h、72 h后,上清液中TGF-β1含量均增加,且呈时间依赖性(P<0.05)。 3.PNS对照组细胞培养24 h、48 h、72 h后,细胞形态学、α-SMA、CTGFmRNA表达及TGF-β1分泌量与同期空白对照组比较差异无显著性(P>0.05)。 4.不同剂量PNS治疗组,细胞培养48 h、72 h后,马兜铃酸诱导的HK-2细胞形态学改变减轻;α-SMA表达IOD值和CTGFmRNA表达相对量较诱导组下降,且呈剂量依赖性(P<0.05);细胞培养24 h、48 h、72 h后,PNS不同程度地抑制TGF-β1分泌,且呈剂量依赖性(P<0.05)。 5.相关分析显示,α-SMA表达IOD值与TGF-β1的分泌量呈正相关(r=0.784,P<0.05),与CTGFmRNA表达相对量亦呈正相关(r=0.916,P<0.05),且CTGFmRNA表达相对量与TGF-β1的分泌量呈正相关(r=0.829,P<0.05)。 结论: 1.建立 AA I诱导HK-2细胞转分化模型的最佳药物浓度为20μg/ml。 2. AA I可通过促进TGF-β1和CTGF的表达诱导肾小管上皮细胞转分化,促进细胞外基质α-SMA的合成,且呈时间依赖性。 3.PNS可负性调节 AA I诱导的肾小管上皮细胞转分化作用,减少α-SMA的表达,且呈剂量依赖性,该作用可能是通过抑制TGF-β1及其下游因子CTGF表达实现的。
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