肺癌是一种最常见的危机人类生命的恶性肿瘤,在各种常见肿瘤中,20 世纪发病率和病死率增长最快的是肺癌。肺癌的诊断及疗效提高发展得极其缓慢,在过去的 20 年里,非小细胞肺癌(NSCLC)患者的生存曲线几乎没有改变,而小细胞肺癌患者由于化疗的发展使生存期有所延长,但没有彻底治愈的病例。研究表明,肺癌的发生是由于某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活和凋亡相关基因的改变所导致的细胞增殖和死亡的异常结果。其发生发展是多阶段、多步骤、多基因参与的过程,在不同阶段相继或同时有不同基因的改变。因此从基因角度进一步阐明肺癌的发生机制具有十分重要的科学意义,已成为肿瘤分子生物学、分子遗传学等领域研究的热点。 近年来,从基因印迹的角度来分析肿瘤的发生机制受到国内外学者的高度重视。2003 年 Sciense 杂志述评中已提出 IGF2 基因印迹的缺失可能为恶性肿瘤的标志物并建议开展基因印迹与肿瘤的研究。基因印迹属于表遗传的范畴,是指精子或卵细胞形成过程中,人类基因组中的一些基因会由于某种结构修饰而不表达出来,或者说“关闭”。这是生物进化过程中形成的一种调节基因表达的重要方式。通常情况下,生物后代会携带同一基因的两个版本,它们分别遗传自父体和母体,在“基因印迹”作用下,其中一个基因版本会处于“关闭”状态。但如果“基因印迹”作用丧失,本应处于“关闭”状态的基因将被错误激活而“开启”,便会因此引发癌症等疾病。基因印迹的缺失(Loss of imprinting,LOI)在许多胚胎和成人肿瘤中被发现,说明它在肿瘤发生发展中具有重要作用。 目前,临床上没有灵敏度高、特异性好的适用于肺癌早期诊断的肿瘤标记物。不仅仅是肺癌,许多恶性肿瘤都迫切需要新的肿瘤标记物或肿瘤分期标记物,及时的对肿瘤进行分期、尽早的开展临床治疗。近来,基因体外扩增技术使得一些生物大分子逐渐成为新的利用价值较高的肿瘤标记物。尤其骨桥蛋白在恶性肿瘤·2·中的高度表达已引起国内外学者的极大关注。骨桥蛋白是一种有多种功能的磷酸化糖蛋白。破骨细胞、肥大细胞、T-细胞、肾细胞、血管平滑肌细胞都可分泌骨桥蛋白。骨桥蛋白引导肥大细胞定位和细胞免疫,诱导新生血管生成,抑制细胞凋亡。此外,骨桥蛋白还维持内环境中钙离子的浓度。(恶性)转化细胞常常分泌大量的骨桥蛋白(包括乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤、鳞状细胞癌)。提示骨桥蛋白与恶性肿瘤的发展及转移关系密切。我们应用现代分子生物学技术研究肺癌及癌周正常肺组织 IGF2、H19、MEST三种基因的印迹状态及骨桥蛋白的表达情况,旨在揭示这三种基因的印迹及骨桥蛋白在肺癌发生机制中的作用,从而为肺癌进一步的早期基因诊断与及时治疗提供理论依据。一.胰岛素样生长因子-2、H19 及 MEST 基因在肺癌中的印迹状态研究背景及目的:基因印迹(genomic imprinting)是指亲源的生殖细胞(即配偶子)特异性地改变引起的体细胞等位基因特异性地表达,是一种不遵循孟德尔遗传学规律调控的现象。这种现象通常与胚胎的生长和生物学行为有关,但有时被印迹的基因也可作为原癌基因和抑癌基因发挥作用,与恶性肿瘤的发生密切相关。近年来,从基因印迹的角度来分析肿瘤的发生机制受到国内外学者的普遍重视。基因印记的缺失(loss of imprinting,LOI)在许多胚胎和成人肿瘤中被发现,说明它在肿瘤发生发展中具有重要作用。胰岛素样生长因子-2(insulin-like growthfactor-2,IGF2)是一种印迹基因,正常情况下只从父源等位基因转录,有报道 IGF2基因的印迹在 Wilms,肿瘤和其他恶性肿瘤,如肾细胞癌,乳腺癌,结肠癌等中是缺失的,而且 IGF2 是过度表达的。在体外实验中已发现 IGF2 在肺癌细胞中是过度表达的。H19 是一种可能作为 RNA 的未知功能基因,它可以抑制转基因小鼠和一些肿瘤细胞系的生长,且与 IGF2 基因共同位于人类染色体 11p15.5,在对一系列胚胎肿瘤和成人肿瘤的研究中发现这两种基因协调性的破坏可能在肿瘤发生中具有重要作用。中胚叶特异性转录子(又名父源表达基因-1)(Mesoderm-specifictransccript/Paternally expressed gene 1,MEST)位于人类染色体 7q32,是一种母源印迹的基因,在许多胚胎组织中表达增高,在乳腺癌中曾报道过 MEST 的频繁缺失。而关于这三种基因的印迹状态与肺癌之间关系的报道国外较少,国内未见这方面的研究资料。本实验根据 IGF2、H19 及 MEST 这三种基因分别具有限制性核酸内切酶 ApaI、RslI 和 AflⅢ位点多肽性的特点,采用现代分子生物学技术研究肺癌及癌周正常肺组织 IGF2、H19 及 MEST 这三种基因的印迹状态及表达情况,旨在揭示这三种基因的印迹在肺癌发生机制中的作用,从而为肺癌进一步的基因诊断和·3·治疗提供理论依据。研究对象及方法:肺癌标本来自大连医科大学附属一院心胸外科 32 例病理学诊断为肺癌的患者,同时取距肿瘤 15 厘米以外的肺组织作为正常对照。将标本基因组 DNA 通过 PCR 扩增,根据 IGF2,H19 和 MEST 三种基因分别具有限制性核酸内切酶 ApaI、RslI 及 AflⅢ位点多肽性的特点,选出各自对应的杂合子信息样本;若为杂合子,其 mRNA 通过 RT-PCR 方法扩增 cDNA,P