背景 随着我国经济的快速发展,牛奶及其制品已成为国民饮食结构中重要的组成部分,也是婴幼儿的重要食品,牛奶相关公共卫生问题也引起学者们的广泛关注。一方面,乳房炎是世界范围内奶牛的高发病,牛奶的高营养成分又使其成为微生物繁殖的良好基质,微生物污染问题一直是畜牧领域和食品卫生领域的研究重点;另一方面,近年来,养殖业中抗生素的广泛应用造成的耐药性增加和耐药基因的迁移也成为关注的热点。目的1调查我国奶牛隐性乳房炎的患病情况,掌握乳房炎致病菌的区系分布。2调查养殖业中抗生素的使用情况,通过表型分型、基因分型和毒力基因检测等方法对重要致病菌的相关特征进行分析,综合评价抗生素应用对乳房炎致病菌多态性的影响。方法 基于代表性和可行性原则选取我国5个省的15个牛群作为采样单位,通过现场走访和查阅记录的方式调查抗生素的使用情况,采用加州乳房炎检测法(CMT)对牛群的隐性乳房炎患病率进行抽样调查。利用传统培养方法对隐性乳房炎患病乳区的牛奶样品进行微生物学检验,对分离株进行生化和分子生物学鉴定,获得致病菌的区系分布。采用微量肉汤稀释法、血清学检验、脉冲场凝胶电泳(PFGE)和PCR方法分别对主要致病菌分离株的耐药谱和耐药基因、血清型、分子分型、毒力基因等表型和基因型特征进行检验和分析。本研究还对牛乳头和榨乳杯内衬涂抹样与乳区奶中致病菌分离株进行了相关性分析。结果 牛群隐性乳房炎患病率调查结果显示,头阳性率为41%～90%,乳区阳性率为14%～41%,阳性牛以单一乳区感染最为常见,阳性率为48.3%(256/530)。抗生素使用情况调查结果显示,防治乳房炎是抗生素使用最常见的原因,治疗用抗生素种类主要包括青霉素、链霉素、头孢噻呋、林可霉素、环丙沙星,干奶期使用的抗生素主要为氨苄西林和盐酸氯唑西林的混剂或苄星氯唑西林。养殖场对药品管理和使用规范好于合作社。本研究共采集乳区奶样品748份,其中,隐性乳房炎奶样527份、正常奶样142份、临床型乳房炎奶样79份。447份样品微生物检测阳性,正常奶样、隐性乳房炎奶样和临床型乳房炎奶样的阳性率分别为40.7%、69.9%、66.2%,共分离出微生物568株,其中细菌536株,真菌32株。检出率最高的4种细菌依次是牛棒状杆菌为21.4%、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)为16.5%、金黄色葡萄球菌为11.4%、无乳链球菌为11.1%。CNS中表皮葡萄球菌和产色葡萄球菌检出率最高,分别为7.8%和3.4%。150份涂抹样品中金黄色葡萄球菌检出率为22.7%。药敏试验结果显示:(1) 111株金黄色葡萄球菌分离株的耐药率为92.8%,多重耐药率38.7%。其中,对青霉素的耐药率最高为90.1%,其次为红霉素48.6%、环丙沙星36.9%、克林霉素27.9%、庆大霉素18.9%、氯霉素9.0%、四环素7.2%,所有菌株对万古霉素和复方新诺明敏感,未检出耐甲氧西林分离株。合作社分离株耐药率为100%,养殖场为87%,两者存在显著性差异(x2=4.80, P<0.05),合作社分离株多重耐药率为54%,养殖场为27%,两者存在显著性差异(x2=8.48,P< 0.05)。(2) 109株CNS分离株的耐药率为85.3%,多重耐药率为42.2%。其中,对青霉素的耐药率最高为76.1%,其次为红霉素49.5%、复方新诺明35.8%、苯唑西林33.9%、四环素22%、环丙沙星12.8%、克林霉素8.3%、氯霉素6.4%、庆大霉素4.6%。(3) 90株链球菌分离株(无乳链球菌68株、停乳链球菌10株和乳房链球菌12株)的耐药率为90%,多重耐药率为33.3%。其中,对四环素耐药率最高为85.6%,其次为克林霉素43.3%,红霉素33.3%,氧氟沙星10%,所有菌株对青霉素、头孢噻肟、万古霉素、氯霉素均敏感。金黄色葡萄球菌分子分型、毒力基因检测结果显示:(1)77株乳区奶金黄色葡萄球菌分离株根据75.2%的相似度可分为7个PFGE型别,各牛群的流行型别为1～4种并以1种为主,7种型别分别在1～8个牛群流行;基于凝固酶基因多态性、辅助基因调节因子、荚膜多糖基因的PCR分型结果与PFGE一致。(2)34株涂抹样分离株中21株与源牛群的乳区奶分离株分为同一 PFGE别型,10株未能被SmaⅠ酶切。(3) 77株乳区奶金黄色葡萄球菌分离株的nuc、coa、hla、hlb、clfA、clfB、ebp、eno、fib、map、spa (X-region)及 spa(IgG-binding region)基因均为阳性,fnbB、can、pvl和超抗原基因的携带率分别为51.9%、42.9%、39.0%、54.5%,超抗原基因中以sei携带率最高为36.4%;fnbB、 can、pvl和超抗原基因在不同PFGE型别菌株中的检出率有差异;所有菌株未检出bbp基因和fnbA基因。无乳链球菌血清学分型、分子分型、耐药基因和毒力基因检测结果显示:(1)68株无乳链球菌的血清分型率为76.5%,Ia型为66.2%,Ⅱ型为10.3%。(2)根据76.8%的相似度分成14个PFGE型别,各牛群以1种型别为主,不同牛群分离株可以有相同的型别;菌株的PFGE型别与血清型别及耐药分布具有一定的相关性。(2) 21株红霉素耐药菌株全部检出ermA、ermB和effA基因,未检出mreA基因和linB基因;62株四环素耐药菌株中有41株菌检出tetM基因,余21株菌检出tet0基因,所有菌株未检出tetK和tetL基因。5种耐药基因在多个PFGE型别均有分布。(3) 68株无乳链球菌对5种毒力基因hylB、glnA、cfb、scaA、cyl的检出率分别为100%、100%、100%、94%、97%,所有菌株均未检测到bac、bca、scpB、lmb 基因。结论 五省牛群的隐性乳房炎患病率较高,牛棒状杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌为优势致病菌,牛棒状杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌的高检出率应引起关注。合作社药品管理和使用规范需要加强。金黄色葡萄球菌分离株耐药情况严重,多重耐药率达38.7%,而且毒力基因携带率高,对乳房炎防治带来较大的压力。链球菌分离株对常用乳房炎治疗药物青霉素敏感,但对红霉素和克林霉素的耐药率高,应警惕耐药基因向人源菌株转移的潜在危害。无乳链球菌对红霉素的耐受机制为甲基化酶对核糖体的修饰作用和膜结合蛋白对药物的外排作用,四环素耐药菌株可能在红霉素耐药的传播中发挥重要的作用。牛群内部金黄色葡萄球菌流行株以一种PFGE型别为主,部分型别可在多个牛群流行,不同型别毒力基因携带情况不同。奶牛的乳头皮肤和榨乳杯内衬可能作为金黄色葡萄球菌的传染源和传播途径。牛源无乳链球菌血清型以Ia型为主,牛群内部无乳链球菌以一种PFGE型别为主,型别分布与血清分型及耐药分布有一定的相关性。