细胞表面过度表达肿瘤相关糖抗原(tumor-associated carbohydrate antigens, TACAs)是肿瘤发生、发展过程中的普遍现象。近二十年来,基于TACAs而进行的抗肿瘤疫苗的合成与研发成为国际糖科学领域的一个研究热点。基于天然TACAs设计的疫苗研究取得了许多突破性的成果,然而绝大多数这类糖疫苗由于不能激起机体产生足够的免疫反应未能通过临床试验。天然TACAs的低免疫原性主要归咎于其在人机体正常组织存在着低水平表达,因而被机体视为“自己”的内源性物质。此外,TACAs对内源性的糖苷酶等敏感,容易被降解导致部分疫苗丢失了糖抗原的完整性,进而降低了其激发特异性免疫反应的能力。为了克服上述问题,对TACAs进行非天然修饰逐渐成为一个有效的解决途径。目前常见的非天然改造方法有在天然TACAs中引入氟代脱氧糖、碳苷以及硫苷等。Thomsen-Friedenreich抗原(TF或T抗原,Galβ1,3GalNAcaSer/Thr)是最为常见的TACAs之一,在90%的肿瘤细胞表面均存在过度表达,如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肺癌等。近来有报道将引入氟取代的T-MUC1糖蛋白类似物应用于抗肿瘤疫苗的研究,并在动物实验中获得了高强度和专一的免疫反应。这是由于氟基团的引入不仅会增强T抗原的免疫原性,同时也有效的改善了其代谢稳定性、脂溶性和生物利用度。尽管氟代策略在药物研发领域得到了广泛应用,且多氟代药物(如LipitorTM, ProzacTM等)在全球药物销售额排名中领先,但是却只有极少的氟代寡糖,包括氟代T抗原及其类似物被合成。这主要是由于氟代T抗原和其它类型含有β1,3-半乳糖苷键寡糖的化学或酶法合成上的挑战性所导致的。氟代寡糖的合成不仅需要反复的保护和脱保护操作,而且氟代糖砌块的反应活性较其相应的天然糖砌块大大降低,因而氟代糖砌块涉及的寡糖化学合成通常需要在剧烈反应条件下(如微波协助,加热等)才能进行,这使得氟代寡糖的合成效率低,总收率不高。因此,迫切地需要发展一个快速、高效、可行的合成策略,来大量获取氟代T抗原及其类似物用于进一步的疫苗活性评价。本论文成功发展了一个以来自于双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)的D-半乳糖-1,3-N-乙酰-D-己糖胺磷酸化酶(BiGalHexNAcP)和来自于大肠杆菌K-12(E. coli κ-12)的重组半乳糖激酶(EcGalκ)催化的一锅双酶反应策略来合成不同类型的β1,3-半乳糖苷键。与半乳糖转移酶催化的糖苷化反应相比,BiGalHexNAcP催化成苷反应直接利用半乳糖-1-磷酸(Gal-1-P)为糖基供体；不需要使用价格昂贵的核苷酸活化的半乳糖(UDP-Gal)给体。另外,我们应用的两个酶EcGalκ和BiGalHexNAcP,均能够在重组大肠杆菌E. coli中获得较高的表达量,能够为大量合成提供足够的酶。并且BiGalHexNAcP的天然催化底物中也表现出了对N-乙酰氨基半乳糖C6-位修饰的一定耐受。因此我们发展的“连续‘一锅双酶法’”合成能够应用于大规模氟代T抗原及其类似物的合成。同时,所合成的氟代T抗原及其类似物可以作为我们所发展的另一个“一锅双酶”体系的底物,以高于90%的收率合成系列唾液酸化氟代T抗原。本课题研究取得的主要成果包括以下几方面。(1)成功地发展出新型“连续‘一锅双酶法’寡糖合成策略”,该策略将成为我们未来合成工作中的一个强有力工具,并有望实现较大范围的推广应用,为制约糖生物学和糖化学生物学发展的寡糖来源问题带来新的解决途径；(2)世界上首次成功地运用“连续‘一锅双酶法’寡糖合成策略”,实现了氟代T抗原系列寡糖的大量、快速、高效合成；(3)首次成功地实现了氟代T抗原的快速、高效“一锅双酶法”唾液酸化修饰；(4)世界上首次人工合成唾液酸化氟代T抗原系列TACAs类似物；(5)本课题高效合成了系列氟代T抗原,说明BiGalHexNAcP具有一定波动范围的底物适应性,能够很好地耐受供体与受体上C6-位氟取代修饰；(6)本课题中C2-位氟代半乳糖被BiGalHexNAcP催化反应的结果,为C2-位氟代糖具有广谱糖链加工相关酶抑制作用的理论提供了准确、可靠的例证支持。