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牛乳过敏是全球普遍关注的食品安全问题之一。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)是导致牛乳过敏反应的重要的过敏原之一,采用共价修饰降低β-LG致敏性已然是当前国际乳制品加工技术的研究热点。有研究表明β-LG抗原性同时受线性表位和构象表位影响,若共价修饰发生在不同位点会对蛋白构象及抗原性产生不同影响。然而目前已有文献中常用的共价修饰大都属于多位点的随机修饰,存在修饰位点选择性低、稳定性不理想、修饰产物不均一等诸多问题,在β-LG致敏性的机理研究上存有较大约束性。为明晰不同位点共价修饰对β-LG抗原性的影响,实现共价修饰对β-LG抗原性的有效调控,需采用定点修饰技术以制备均一化修饰产物,针对特定基团或位点进行修饰以从机理上探究不同位点对蛋白致敏性的影响。故本研究首次采用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)定点修饰方法针对β-LG第121位游离巯基,通过使用不同分子量5kDa及10 kDa单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG-MAL)对其进行定点修饰,制备纯化得到均一化PEG-β-LG单修饰产物,并对修饰前后蛋白结构及致敏性变化进行探究,通过实验结合理论探讨阐明PEG定点修饰β-LG游离巯基对蛋白构象变化与致敏性间的关系,为β-LG致敏性的有效调控提供理论基础。研究主要方法、结果及结论如下:1.采用mPEG-MAL对β-LG第121位游离巯基进行定点修饰,对反应时间、反应pH值、修饰剂用量、还原剂用量等修饰条件进行优化,获得制备高修饰率结合产物的最优条件;并使用SDS-PAGE及凝胶过滤色谱分析PEG-β-LG修饰产物的表观相对分子量及修饰率。结果表明:修饰剂用量及反应时间是影响修饰产物得率的主要因素,反应pH值影响甚微。mPEG-MAL与β-LG的最佳反应条件为:β-LG与PEG摩尔比1:30、β-乳球蛋白与TCEP摩尔比1:3,在0.01M的磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0,含2mM EDTA及25%乙醇)中4℃反应24h。2.采用阳离子交换层析对5 kDa及10 kDa mPEG-MAL与β-LG的修饰产物进行分离纯化,并通过SDS-PAGE凝胶电泳结合MALDI-TOF-MS进行鉴定分析。SDS-PAGE凝胶电泳表明5 kDa mPEG-MAL与β-LG的修饰产物(β-LG-PEG5K)及10kDamPEG-MAL与β-LG的修饰产物(β-LG-PEG10K)均仅有一条单一条带,表观分子量分别为28 kDa及38 kDa;MALDI-TOF-MS分析显示β-LG-PEG5K及β-LG-PEG10K实际分子量为23.6 kDa及28.7 kDa。鉴定结果表明所制备修饰产物均为单个PEG分子与单个蛋白连接的单修饰产物。凝胶过滤色谱显示所制备修饰产物纯度均达90%以上,修饰产物有较高均一性;β-LG经mPEG-MAL修饰后,β-LG-MAL5K及β-LG-MAL10K蛋白游离巯基含量从52.34±0.13 μmol/g pro 降为 0.28±0.19μmol/g pro和0.12±0.08μmol/gpro,表明PEG分子结合在β-LG第121位游离巯基。3.对修饰前后蛋白的结构及致敏性变化进行测定。研究显示β-LG致敏性同时受线性表位及构象表位影响,结构变化会对蛋白构象表位造成影响,因而通过圆二色谱、内源荧光及表面疏水性含量测定对蛋白修饰前后结构变化进行表征。结果显示,经修饰后蛋白结构发生部分去折叠,β折叠含量约降低7%,无规则卷曲含量约升高6%,内源荧光强度有所增强。间接竞争ELISA法表明修饰后蛋白抗原性有显著性提升。通过实验结合理论推导分析修饰前后蛋白结构变化与致敏性间的关系。β-LG-MAL抗原性测定结果前期实验截然不同,与前期不同位点修饰进行比较,经巯基修饰后β-LG抗原性显著提升,推测原因是由于结合位点位于致敏能力较强的肽段AA102-124导致线性表位发生变化,致敏表位暴露,蛋白结构发生部分去折叠导致形成新的构象表位,在这两方面作用下使得蛋白致敏性增强。同时验证与普通共价修饰相比,采用PEG定点修饰能有效探究不同位点对β-LG抗原性的影响。