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肝癌是恶性程度极高，预后极差的恶性肿瘤。目前各种治疗手段并不能从根本上改变肝癌患者的预后。基因-病毒治疗成为一种新的治疗手段开始应用于肝癌的治疗。白细胞介素在免疫应答和调节中起到重要的作用，其中IL-21主要由活化的CD4+T细胞分泌,能增强效应T细胞及活化的NK细胞的功能[1-2]，从而有效增强机体的天然免疫以及特异性免疫反应，对肝癌具有良好的治疗效果，本课题选择刺激T细胞增殖、抗肿瘤的IL-21基因[3-6]，并利用腺病毒载体携带该基因对肝癌进行治疗，同时利用T细胞作为细胞载体携带腺病毒逃避免疫系统的监控，从而使腺病毒有效地到达肿瘤部位，提高静脉注射后腺病毒到达肿瘤细胞的效率，以便更有效的治疗肝癌。ITR[1-2]是腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）基因组的末端重复序列，每个ITR长145bp。其中前125bp可形成一个T形的发夹结构，由两个小回纹结构（palindrome）组成，旁边为一个较大的回纹结构。ITR的序列可有两种构型：flip（B回纹接近3′端）或flop（C回纹接近3′端）。一个特定分子AAV的两个末端形成flip或flop的机率都相等。单链形式的AAV ITR容易形成的T型发夹结构，还可能形成另外的构型。ITR序列是AAV病毒的复制、整合、拯救和包装所必需的顺式作用元件。本实验选择构建的腺病毒为非增殖型腺病毒，其在宿主细胞内存在的数量完全由刚开始进入细胞的病毒滴度决定，为了使其在宿主内的数量扩增，本课题在腺病毒载体的末端加入了ITR结构[3]，即包装出来的腺病毒包含AAV的ITR结构。因此命名病毒为Ad5/AAV、Ad5F35/AAV。腺病毒能够高效感染多种细胞，其基因组可插入较大的外源目的基因片段，并能够快速启动目的基因表达，但其基因组不能够复制而影响了目的基因的表达，而腺相关病毒的基因组可因其末端反向重复序列ITR的存在发生复制，使目标基因在靶细胞中长期表达。本实验主要有以下三部分组成：一、表达hIL-21的腺病毒载体的构建和制备使用PCR方法将hIL-21基因从pDC318-hIL-21模板中扩增出来，然后使用限制性内切酶SalI、BamHI酶切hIL-21和pDC759，然后将处理后的片段连接到载体片段上，即得到质粒载体pDC759-hIL-21。将质粒载体pDC759-hIL-21与腺病毒骨架载体pAd5、pAd5F35共转染293细胞，10天后出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，提取病毒基因组进行PCR鉴定，鉴定正确的腺病毒命名为Ad5/AAV-hIL-21、Ad5F35/AAV-hIL-21。经293细胞扩增、氯化铯密度梯度离心纯化、TCID50测得病毒Ad5/AAV-hIL-21、Ad5F35/AAV-hIL-21滴度分别为8.95×109pfu/mL、2.65×1010pfu/mL。同时本实验也构造了携带含有CopGFP的5型以及35型腺病毒分别命名为Ad5/AAV-CopGFP、Ad5F35/AAV-CopGFP，二者的滴度分别为5.15×109pfu/mL、7.1×109pfu/mL。二、CIK细胞的培养以及体外表达实验这部分的研究主要是基于构建好的病毒其在体外条件下，基因组表达框的表达能力的一个鉴定以及在体外条件下5型腺病毒与35型腺病毒对CIK细胞感染能力的对比；探索不同MOI情况下最大感染能力的优化和选择，以便推论出最优的感染条件。为了得到这个结果，本实验做了如下实验研究：首先，本实验选用Ad5/AAV-CopGFP、Ad5F35/AAV-CopGFP以不同MOI感染CIK细胞，其MOI的控制梯度分别为1，5，10，50，100，1000。感染48、96hr后分别在荧光显微镜下观察其各种条件下的荧光强度，本实验证明了Ad5F35/AAV-CopGFP对CIK细胞的感染能力远远强于Ad5/AAV-CopGFP对CIK细胞的感染能力。并且，随着MOI的增加Ad5F35/AAV-CopGFP对CIK细胞的感染能力逐渐增强，但是在MOI增加到1000的时候Ad5F35/AAV-CopGFP对CIK细胞的感染能力会有所下降，原因是因为在该MOI的条件下，Ad5F35/AAV-CopGFP对CIK细胞有一定的杀伤作用，所以在MOI为50的条件下Ad5F35/AAV-CopGFP对CIK细胞的感染能力是较为合适的，本实验选择该条件为下面实验的一个参照比值。其次，本实验用Ad5/AAV-hIL-21、Ad5F35/AAV-hIL-21对SMMC-7721细胞株进行感染，MOI的梯度设置为0，1，5，10，20。在病毒感染细胞48hr后收取上清进行检测，使用ELISA试剂盒检测hIL-21的表达量，同时使用Ad5F35/AAV-hIL-21对CIK细胞进行感染，MOI的梯度设置为0，1，5，10，50，100，使用ELISA试剂盒检测hIL-21的表达量。检测的结果显示Ad5/AAV-hIL-21、Ad5F35/AAV-hIL-21对SMMC-7721细胞株的感染能力相似，并且表达情况也差的不是很大，在MOI为20的情况下hIL-21的表达量较高。再次，本实验对CIK细胞的生长进行一个比较系统的研究，并且绘制了22天CIK细胞的生长曲线，本实验研究发现，随着转袋后培养，第六天以后，调节好CIK的密度为一个较高的水平，在以后的时间CIK的生长呈现倍增的生长趋势。在培养第20天以后CIK的数量基本上维持不变，其生长状态开始出现停滞，在以后的时间里CIK的生长出现衰退的状况，因此，在CIK细胞培养到12天以后开始作为荷瘤小鼠治疗的时间。三、表达hIL-21的CIK细胞体内治疗肝癌的体内实验研究本实验皮下注射5×106个/只SMMC-7721细胞用于建立裸鼠肝癌模型。1、CIK细胞基因治疗系统对裸鼠移植瘤的抑制作用，CIK/Ad5F35/AAV-hIL-21治疗组疗效明显优于PBS对照组，具有明显的统计学意义（P<0.05）。2、CIK细胞基因治疗系统对荷瘤裸鼠生存期的影响。PBS对照组在治疗开始后第27天开始出现死亡，100天内全部死亡。直至对照组小鼠全部死亡时，CIK/Ad5F35/AAV-hIL-21治疗组小鼠全部存活。基于体外实验的一个研究结果，本实验选用裸鼠作为荷瘤小鼠的实验动物，并且本实验选择SMMC-7721细胞作为荷瘤小鼠造模的细胞，在每个小鼠的皮下注射5×106个细胞。在裸鼠成瘤以后，进行治疗，治疗的分组在下面的实验研究中会进行详细的介绍。治疗的疗效主要分为，效果指标和生存指标，本实验的研究结果显示当Ad5F35/AAV-hIL-21感染CIK细胞后尾静脉回输到荷瘤小鼠体内之后，肿瘤的治疗效果较为显著。结论：本课题成功构建了同时携带hIL-21基因的嵌合型腺病毒Ad5F35/AAV-hIL-21，并且该病毒高效感染CIK细胞，且高表达hIL-21。CIK/Ad5F35/AAV-hIL-21治疗系统能显著抑制裸鼠移植瘤和延长裸鼠生存期。该方案综合了肿瘤细胞治疗和基因-病毒治疗的双重优势，克服了基因-病毒治疗系统体内运输病毒效率低的缺陷，也弥补了单纯肿瘤细胞治疗效果差的不足，对肝癌具有显著的抑制作用，有望成为肝癌治疗新的突破。