提升傅里叶叠层显微成像质量的研究

来源 :中国科学院大学(中国科学院长春光学精密机械与物理研究所) | 被引量 : 2次 | 上传用户:wanming_home
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分辨率和视场是光学成像系统中一对难以调和的矛盾,因此显微镜的信息通量通常在百万像素级,在数字病理成像、血液涂片成像等应用中不能满足(波长级分辨率和10mm大视场)使用要求。现有的数字病理系统只能使用小视场的高倍分辨物镜与视场的机械扫描系统结合然后通过图像拼接来满足高分辨和大视场的要求,其结构复杂、价格昂贵。傅里叶叠层显微术(Fourier ptychographic microscopy,FPM)将普通显微镜的钨丝灯或卤素灯光源替换为一个LED阵列光源,使用大视场的低分辨物镜采集一系列不同照明角度的显微图像,这些图像分别对应样品频谱的不同子区域,可以通过频谱拼接来扩展样品图像的频谱范围,用傅里叶叠层重建出高分辨率振幅和相位图像,能实现亚波长分辨率和11mm的大视场,形成十亿像素级的信息通量,满足数字病理成像要求,另外其中的相位图像还能用于未染色样品的成像,扩展了生物显微成像的功能,此外还有光学系统像差校正等应用。同时FPM的光学结构简单,价格低廉,具有极大的发展前景。但是,FPM技术目前还不成熟,不同角度LED的光照度不同、大角度采集图像的信噪比低、传递函数简化误差、收敛错误导致颜色误差等问题降低了FPM的图像质量,图像识别率还达不到应用要求。本文针对这些问题,开展了以下研究内容:首先,设计并搭建了一套FPM成像实验验证系统,使用225个LED分别照明成像,理论上能重建出波长级分辨率的图像,可以很容易推论如果使用更多LED时将可获得更高的分辨率。实验中看到当照明角度大于物镜孔径角时采集到的图像变为信噪比较低的暗场图像,依据现有报道的解决方案统一延长了暗场图像的相机曝光时间,但在实验中发现分辨率板的重建图像在高分辨率区存在“空心化”的失真问题。通过傅里叶变换三角函数波的叠加分析得出,该问题源于高频信息权重过大,而FPM的高频信息对应照明角度较大的暗场图像,即暗场图像曝光时间过长,说明一刀切地延长所有暗场曝光时间的解决方案过于粗糙,须按实际系统定量化作出修正。实验中对于不同角度斜照明的LED在样品面上的光照度进行了严格分析,得出光照度与照明角度α的变化函数Iα=I0cos8α及其对重建图像质量的影响:高频分量减小,图像细节部分模糊。据此提出了定量化的曝光时间补偿曲线Tα=T0/cos8α,准确增加斜照明时相机曝光时间来补偿降低的光照度,有效解决了精细结构中的“空心化”问题,显著提升重建图像的细节辨识力。第二,虽然“空心化”得到了解决,重建图像能够达到波长级分辨率,但由于相对降低了暗场图像曝光时间使图像噪声更为突出,虽然叠层重建后图像噪声点有所抑制,但仍会导致图像细致结构的辨识失误。现有的几种去噪算法难以应对这种高水平的噪声且计算效率低。为此提出了一个两步走的去噪算法:首先寻找含有噪声的像素点,即利用一次FPM重建的图像,将其降阶为采集图像的坐标系,降阶的重建图像由于傅里叶叠层算法滤除了部分噪声,然后与实际采集图像相减得到一个对应像素阵列的灰度差分矩阵,矩阵中各像素灰度值即认为是所采集图像中该点的噪声值,从而找到每个噪声的位置及噪声值;下一步是依据差分矩阵生成一个同样大小的权重矩阵,使采集图像中噪声值较大的像素点在重建过程中权重较小,而噪声值较小的点在重建过程中权重较大,从而达到去噪效果。经数值模拟,将差分矩阵中的灰度值分为4档,依次为强、中、中下、弱,对应这4挡数值为差分矩阵重新赋值为(0.2/0.4/0.6/0.8)的阶梯型数值,从而生成权重矩阵,将权重矩阵施加到所采集的图像上,看到噪声被大幅抑制。将该算法命名为稀疏采样去噪算法,在模拟和实验的噪声数据集上与现有去噪算法作了比较,对于方差为0.006的高斯噪声,能使重建图像的均方误差由0.0024进一步减小到0.0018、结构相似度由0.53提升为0.64,优于其它去噪算法,同时该算法拥有最快的运算速度,仅增加约15%的运算量。第三,针对LED照明的FPM系统成像模型进行了分析,通常人们把孔径处频域传递函数简化为孔径内部透过率为1、外部透过率为0的平面函数,等效于相干传递函数,用作重建过程中的频域约束。然而,LED并非相干光源,这种简化会使得重建图像中引入虚假的斑点,降低识别效果。通过时间和空间相干性分析,证明了FPM为部分相干光源系统。进而分析了部分相干和相干光源照明下相机上的成像结果,发现相干光照明下的采集图像存在强烈的衍射波纹即所谓的振铃效应,而部分相干系统则受影响较小。受启发于光学成像中去除振铃效应的切趾法,提出用切趾的相干传递函数作为重建算法中的频域约束,很好地消除了重建图像中的虚假斑点。最后,对彩色FPM图像重建中图像颜色误差大和速度慢的问题,根据图像重建过程中仅需输入强度的特点,提出基于HSI模型的彩色FPM图像重建方法,该方法先将RGB彩色图像变换到HSI模型,仅重建彩色图像中的I(强度)分量,并用保留的H和S分量为重建结果“上色”。与其它彩色图像重建方法比较,该方法很好地保留了采集图像中的色彩,不会使色彩失真;且可同时使用RGB三色光照明而一次性采集全彩图像,使图像采集时间和重建时间都减少到传统方法的1/3。本论文围绕FPM重建图像的质量,解决了细节空心化、暗场噪声、相干传函模型造成的虚假斑点和彩色重建图像颜色误差大速度慢等关键问题,对FPM技术的临床应用具有重要的推动和指导意义。
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