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角质酶（cutinase,EC 3.1.1.74）是一类可水解各种长链、短链脂肪酸酯,以及可降解不溶性角质等的水解酶,属于α/β水解酶家族。角质酶作为一种多功能水解酶,在食品、化工、洗涤、造纸等诸多领域都具有广泛的应用。近年来,角质酶在纺织工业中的应用潜力逐渐被人们挖掘。角质酶可破坏棉纤维角质层,并帮助去除果胶、蛋白质等杂质从而达到纺织品的精练效果。本研究室在前期研究工作中,首次鉴定并表达了一种来源于嗜热子囊菌（Thermobifida fusca）的细菌角质酶Tfu0883,发现其具有热稳定性好,耐高温,耐极端pH等优良特性,符合工业化应用的实际需求,具有巨大的产业化应用潜力。本研究在此基础上,以发酵常用菌株BL21 Star（DE3）为表达宿主菌,通过对其表达分泌系统的探究与改造以期获得重组角质酶高效胞外分泌的最佳策略。本研究的具体内容及成果包括以下方面:1、对外膜脂蛋白基因lpp进行了成功的敲除,并初步考察了敲除菌的生长及发酵产酶情况。鉴于细胞膜透性在重组蛋白跨膜转运方面的重要地位,本研究首先以发酵常用菌株BL21 Star（DE3）为表达宿主菌,对细胞外膜的重要组成部分lpp外膜脂蛋白基因进行敲除,以增大其外膜透性。对敲除菌的进一步产酶研究发现,lpp敲除对于发酵前期影响明显,促进了重组角质酶在前期达到较高的胞外分泌水平,使发酵周期从之前的60h-72h缩短至36h-48h; 2、通过共表达SecA及SecM-SecA内膜转运伴侣蛋白,对增强内膜转运能力进行了探索性研究。重组蛋白的内膜转运是一系列涉及多种转运伴侣蛋白、膜蛋白以及其与重组蛋白相互作用的复杂过程,而内膜转运系统涉及诸如SecA特殊精密表达调控等复杂机理,是一项需要细致深入研究的系统工程。本研究从SecA表达调控机理入手,通过共表达SecA伴侣蛋白以及共表达SecM-SecA调控体系,考察内膜转运伴侣蛋白的过量表达对于重组角质酶胞外分泌的影响。根据细胞内仍有明显包涵体分析可知,由于表达强度与分泌能力不匹配,未完成折叠的重组角质酶在内膜附近形成无生物活性的包涵体,因此采用单纯共表达SecM-SecA等提高蛋白转运能力的单一手段并不能有效提高重组蛋白的胞外分泌效率;3、运用TIR突变技术,探索了低合成强度下角质酶高效胞外生产的潜力。从重组蛋白的合成强度入手,运用TIR简并突变技术,获得了从对照组的1/10到对照组4倍的合成梯度强度。从中选取合成强度减弱为一半的突变株,将该突变基因应用至pET表达系统,并以lpp敲除菌为宿主,对重组菌的生长及发酵进行了探索研究。研究发现,使用合成强度降低的重组载体在37℃下进行发酵生产分泌效率有明显的提高,发酵周期缩短。这表明,低合成强度下的重组蛋白胞外分泌有着进一步优化的潜力;4、考察了化学添加剂等对发酵产酶的影响,并优化了发酵策略。根据细胞膜转运重组蛋白的机理,本研究相继考察了各种金属离子、电子受体、表面活性剂等添加剂对发酵的影响研究发现,添加高价铁离子及硝酸根离子等电子受体离子,并不能通过增强电子传递链的效率来推动内膜转运的进程。作为一种非离子型表面活性剂,TritonX-100对于细胞膜透性有着良好的促进作用,当TritonX-100终浓度为0.1%时,菌体生长未受明显影响,而胞外产酶量及分泌比率均达到了80U/mL和60%,是原始出发菌株的2倍。