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第一部分:强直性脊柱炎髋关节韧带基质降解和血管生成增加研究背景:强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)是一种自身炎症性疾病,炎症常常累及中轴关节及外周大关节的肌腱韧带附着点,晚期韧带肌腱附着点部位易形成韧带骨赘,而炎症和新骨形成常伴发有血管再生。髋关节作为AS中最常受累的外周大关节,目前国内外的研究中,还没有关于AS髋关节韧带中血管再生方面的研究。研究目的:本部分实验中,我们在手术的过程中获取AS和股骨颈骨折(Femur Neck Fracture,FNA)髋关节周围韧带分别作为实验组和对照组,研究AS髋关节周围韧带是否伴发有血管再生增加。实验方法:血管周围基质降解是血管再生的第一步。我们通过RT-PCR检测纤连蛋白(fibronectin),层黏连蛋白(Laminin),1型胶原(Collagen 1),4型胶原(Collagen 4),基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP1,MMP2,MMP9),基质金属蛋白酶抑制剂(inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMP1,TIMP2,TIMP3)表达水平的变化来证明血管周围基质降解情况。CD31是血管内皮细胞的表面标志物,Fibronectin和Laminin是能反应血管周围基质降解情况,我们通过CD31与Fibronectin,CD31与Laminin双标免疫荧光的方法来证明AS髋关节周围基质降解,血管密度及其形态的变化。实验结果:RT-PCR结果提示,与FNF髋关节韧带对比,AS患者髋关节韧带组织中MMP1,MMP2,MMP9表达分别增加7.21倍,2.17倍和2.19倍,而Fibronectin,Laminin,Collagen1,Collagen4,TIMP1,TIMP2,TIMP3表达分别降低1.92倍,2.44倍,2.04倍,2.63倍,2.33倍,10.73倍,2.78倍。双标免疫荧光结果提示,与FNF相比,AS患者髋关节韧带组织血管密度增加,Fibronectin,Laminin表达水平明显降低,这些结果证明在AS髋关节韧带组织中血管周围基质降解增加,血管再生增加。结论:与FNF髋关节韧带组织相比,AS髋关节韧带组织中基质降解增加,血管再生增加。第二部分:强直性脊柱炎髋关节韧带组织及成纤维细胞中Ang1表达增加,TNF-α刺激AS成纤维细胞后Ang1及Tie2表达增加研究背景:血管再生过程中,许多细胞因子参与其中,包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),成纤维细胞生长因子,血管生成素家族(Angiopoietins,Angs)及其受体等。本课题组之前的基因芯片结果已经证实Angs家族中的Ang1在AS髋关节韧带组织中表达上调。研究目的:本部分实验中,我们将进一步证明Ang1、Ang2、Tie2受体及CD31在AS髋关节韧带组织中表达水平的变化,Ang1,Ang2在成纤维细胞中表达水平的变化。TNF-α刺激成纤维细胞,探索引起AS中Ang1表达上调的原因。实验方法:首先,我们通过RT-PCR在基因水平检测AS髋关节组织中Ang1,Ang2,Tie2表达水平的变化,通过Western-Blot在蛋白水平检测AS测髋关节组织中Ang1,Ang2,Tie2表达水平的变化。通过免疫组化对Ang1,Ti2及CD31行半定量和定位检测,通过CD31与Tie2双标免疫荧光法定位Tie2表达部位。其次,获取韧带组织后,胶原酶消化法获取成纤维细胞,通过CD90和CD29鉴定成纤维细胞。通过RT-PCR和Western-Blot方法分别检测AS成纤维细胞中Ang1,Ang2及Tie2在基因水平和蛋白水平的变化。通过Ang1与CD90双标免疫荧光方法检测AS成纤维细胞中Ang1表达变化,并对Ang1合成部位进行定位分析。通过ELISA的方法检测成纤维细胞培养上清液中Ang1,Ang2浓度。最后,为了进一步探讨引起AS成纤维细胞中Ang1表达上调的原因,我们用TNF-α刺激成纤维细胞后检测Ang1配体和Tie2受体的表达。实验结果:RT-PCR结果提示,与FNF的髋关节韧带组织相对比,AS的髋关节韧带组织中Ang1,Ang2,Tie2表达分别上调5.32倍,3.56倍和2.13倍。Western-Blot结果提示,AS髋关节韧带组织中Ang1,Ang2,Tie2的表达增加,对其定量分析提示,AS髋关节韧带组织中Ang1(P<0.001),Ang2(P<0.001),Tie2(P<0.001)蛋白的灰度值明显高于FNF,而Ang1灰度值/Ang2灰度值的比值没有差异。免疫组化的结果提示,AS髋关节韧带组织中Ang1,CD31,Tie2蛋白表达均上调,Ang1蛋白在血管周围及其远离血管的部位均有表达,Tie2主要在血管周围表达。CD31与Tie2双标免疫荧光结果证实Tie2在主要在内皮细胞上表达。细胞鉴定结果提示,胶原酶消化法获得的细胞81.1%为成纤维细胞。成纤维细胞RT-PCR与Western-Blot的结果提示,AS成纤维细胞中Ang1在基因水平及蛋白水平表达均上调。CD90与Ang1双标免疫荧光结果提示Ang1在AS成纤维细胞胞浆中的表达明显高于FNF,ELISA结果提示,AS成纤维细胞上清培养液中Ang1的浓度明显高于FNF(36.3±5.08 ng/ml VS 17.06±1.54 ng/ml,p<0.001)。当用TNF-α刺激AS成纤维细胞后,Ang1以剂量依赖的方式表达上调,并且Ang1的受体Tie2也以剂量依赖的方式表达上调,FNF成纤维细胞中未发现这种情况。结论:与FNF相比,Ang1,Ang2,Tie2无论基因水平还是蛋白水平在AS髋关节韧带组织中均表达增加。Tie2受体在AS髋关节韧带组织中表达增加,并且主要在的内皮细胞中表达。AS成纤维细胞中,Ang1在基因和蛋白水平均表达增加,由胞浆合成分泌至细胞外,通过旁分泌的方式作用在韧带组织中的内皮细胞上。TNF-α能刺激AS髋关节韧带成纤维细胞,Ang1配体及Tie2受体表达上调,可能与AS本身的炎症性病理变化有关。第三部分:AS成纤维细胞上清液及COMP-Ang1促进了内皮细胞的迁移和小管形成研究背景:血管再生由血管周围环境所决定,当周围环境不能为组织提供足够的营养物质和氧气时,低氧组织就是释放促血管再生因子,促使内皮细胞从已有血管的上出芽形成新的血管。血管再生的过程中,血管周围基质的降解是第一步,第一部分实验已经证实。随后内皮细胞从原有血管的上通过出芽,形成分枝,每一个新的出芽都会通过尖端细胞与周围的出芽连接起来,最终形成连续的管腔。血管再生是多基因共同作用的结果,那么,COMP-Ang1与成纤维细胞上清液能否促进内皮细胞的迁移和小管形成呢?研究目的:本部分实验的目的是检测AS和FNF成纤维细胞细胞上清液中Ang1/Tie2信号系统是否能促进内皮细胞的迁移和小管形成,同时用Ang1的重组蛋白COMP-Ang1检测其是否促进内皮细胞的迁移和小管形成,以验证Ang1促进血管再生的作用。实验方法:通过划痕实验证明Ang1/Tie2信号系统能促进内皮细胞的迁移,通过体外小管形成实验证明Ang1/Tie2信号系统能促进内皮细胞的血管管腔形成。实验结果:实验结果提示,AS与FNF成纤维细胞条件培养基均能促进内皮细胞的迁移和小管形成,AS成纤维细胞条件培养基的作用更加明显。COMP-Ang1以剂量依赖方式促进内皮细胞的迁移和小管形成,当在内皮细胞培养液中加入Tie2抑制剂后,内皮细胞的迁移和小管形成明显被抑制。说明Ang1/Tie2信号系统能促进内皮细胞迁移和小管形成。结论:Ang1/Tie2系统通过促进内皮细胞迁移和管腔形成而促进血管再生。第四部分:Ang1通过Notch-1信号通路调节血管再生研究背景:我们的实验研究已经证明Ang1/Tie2在AS髋关节韧带及成纤维细胞中高表达,并且能促进内皮细胞的迁移和小管形成。然而,目前Ang1/Tie2通过何种信号通路促进血管再生的机制还不完全明确,研究表明在类风湿性关节炎的滑膜中,VEGF/Ang2能通过Notch-1信号通路共同促进血管形成[1],也有研究表明,酒精以Notch-1信号通路和Ang1依赖的方式促进内皮细胞的成血管活性[2]。然而,Ang1/Tie2信号系统与Notch-1信号通路在调节血管再生之间的相互关系并没有研究。研究目的:本部分实验旨在研究Ang1/Tie2信号系统与Notch-1信号通路之间的关系,证明Ang1/Tie2信号系统通过Notch-1信号通路调节内皮细胞的迁移和小管形成。实验方法:首先,验证COMP-Ang1是否激活Notch1信号通路。用不同浓度的COMP-Ang1刺激内皮细胞,通过RT-PCR从基因水平检测Notch-1及其下游靶基因Hey1,Hey2,Hes5的变化,通过Western-Blot从蛋白水平检测Notch-1受体及其配体DLL-4表达的变化。随后,COMP-Ang1刺激内皮细胞的同时加入Tie2受体抑制剂抑制Ang1/Tie2信号系统,同样通过RT-PCR从基因水平检测Notch-1及其下游靶基因Hey1,Hey2,Hes5的变化,通过Western-Blot从蛋白水平检测Notch-1受体及其配体DLL-4表达的变化。其次,验证Ang1/Tie2信号系统通过Notch-1信号通路调节血管再生,以不同的COMP-Ang1浓度刺激内皮细胞,检测其对内皮细胞的迁移和小管形成的影响,随后在加入COMP-Ang1刺激内皮细胞的同时加入γ分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch-1信号通路,检测其对内皮细胞的迁移和小管形成实验的影响。实验结果:不同浓度的COMP-Ang1刺激内皮细胞后,Notch-1受体及其DLL-4配体在内皮细胞中以剂量依赖的方式表达上调,其下游的靶基因Hey1,Hey2,Hes5表达也上调。同样不同浓度的COMP-Ang1刺激内皮细胞,同时抑制Tie2受体后,与无COMP-Ang1刺激组内皮细胞相对比,Notch-1受体及DLL-4配体表达无变化,同时其下游的靶基因Hey1,Hey2,Hes5表达也无明显变化。当以不同浓度的COMP-Ang1刺激内皮细胞后,内皮细胞的迁移和小管形成增加。不同浓度的COMP-Ang1刺激内皮细胞的同时抑制Notch-1信号通路后,与无COMP-Ang1刺激组内皮细胞相对比,内皮细胞的迁移和小管形成无明显变化。结论:Ang-1/Tie2信号系统可能通过Notch-1信号通路调节血管再生。