结核分枝杆菌感染导致的结核病仍然威胁着全球人类健康。由于多药物耐受和广泛耐药结核分枝杆菌的出现,尤其是HIV共感染,结核病的形势极其严峻。结核分枝杆菌能够通过多种机制逃逸宿主免疫系统是其作为成功病原菌的原因之一。从结核分枝杆菌基因组解密揭示了重要的信息,包括重要的PE/PPE蛋白家族。结核分枝杆菌PE/PPE家族蛋白是由PE和PPE亚家族构成,占结核分枝杆菌编码能力的10%。PE亚家族是根据其N末端保守的P(Pro)-E(Glu)而命名,含有100个成员,具有由110个保守的氨基酸残基编码的N末端结构域,而其C末端序列长度大小不一,并富含GC核苷酸的重复序列PGRS。PE亚家族含有37个pe编码基因和61个pe_pgrs基因。PPE亚家族是根据其N末端Pro(P)-Pro(P)-Glu(E)序列命名,包含69个成员,根据其C末端结构域特征主要分为三类PPE_SVP,PPE_PPW和PPE_MPTR亚家族。这些蛋白特有的序列可能暗示了它们在结核分枝杆菌感染中具有特殊的生理功能。PE/PPE家族蛋白几乎只存在于分枝杆菌中,尤其是病原分枝杆菌,这一特点引起了许多研究者的青睐。一些好的综述总结了PE/PPE家族的起源,定位,表达调控以及生理功能。越来越多的证据表明PE/PPE蛋白在分枝杆菌发病机制中扮演非常重要的角色。PE/PPE基因的起源与分枝杆菌VII型分泌系统相关。已经报道一些与毒力相关的转录因子参与PE/PPE蛋白家族调控,包括严紧反应调节子Rel A,ESX-1相关的调节子Esp R,全局性转录调控因子Lsr2以及Sigma因子如sig F,sig B和sig D。PE/PPE家族蛋白定位于分枝杆菌细胞壁,这表明该家族蛋白在病原菌-宿主相互作用中发挥重要的功能。巨噬细胞是防御外界细菌感染的第一道防线,能够分泌多种细胞因子调节炎症反应。当结核分枝杆菌感染巨噬细胞或小鼠后,一些PE/PPE基因出现差异表达,暗示PE/PPE蛋白操控宿主巨噬细胞活性。一些PE/PPE蛋白具有免疫原性和免疫反应性,可能促进抗原变异。PE/PPE蛋白可能与分枝杆菌毒力相关并促使分枝杆菌在巨噬细胞内生存,最终导致免疫逃逸。首先我们所研究的由rv1169c编码的PE11,由于该蛋白具有潜在的脂肪水解酶活性,因此被命名为Lip X。另外,rv1169c在酸性条件下的表达提高以及被认为是潜在的疫苗靶标。本文首先我们构建了能够表达Rv1169c蛋白的重组耻垢分枝杆菌(简写为Ms_Rv1169c)和空载体重组耻垢分枝杆菌(简写为Ms_Vec)。通过高速离心分级分离细胞质和细胞壁并用Western证明Rv1169c蛋白定位于分枝杆菌细胞壁。通过GC-MS分析细胞壁脂肪酸组分发现Ms_Rv1169c与Ms_Vec细胞壁脂肪酸组分存在明显的差异。接着发现Ms_Rv1169c在体外压力条件下对SDS和酸更为敏感,同时对抗生素利福平和诺氟沙星非常敏感,这说明Ms_Rv1169c通过改变了细胞壁脂肪酸组分而对外界压力以及抗生素更为敏感。另外,重组菌Ms_Rv1169c在巨噬细胞中的存活率显著增加,而Ms_Rv1169c和Ms_Vec在体外培养基中的生长没有显著差异,这表明Ms_Rv1169c在胞内存活率增加可能是通过某种机制调控了宿主免疫反应或巨噬细胞死亡。荧光定量PCR证明Ms_Rv1169c刺激巨噬细胞在转录水平上上调IL-6 m RNA水平,而ELISA证明Ms_Rv1169c刺激巨噬细胞在翻译水平上降低了IL-6的分泌。另外,Rv1169c蛋白可能帮助耻垢分枝杆菌诱导巨噬细胞死亡。总之,我们在此证明M.tuberculosis Rv1169c蛋白调节巨噬细胞IL-6分泌并诱导巨噬细胞死亡。首次报道Rv1169c蛋白可能直接或间接参与分枝杆菌脂肪酸代谢,导致细胞壁脂肪酸组分发生显著变化。然而,Rv1169c蛋白如何改变分枝杆菌细胞壁脂肪酸组分,以及对SDS、酸以及抗生素的敏感性,增加耻垢分枝杆菌在胞内存活,加速巨噬细胞裂解以及改变宿主分泌细胞因子以及其相互作用关系还有待于进一步进行研究。我们研究了PPE亚家族由rv1808基因编码的PPE32蛋白。构建了表达Rv1808蛋白的重组耻垢分枝杆菌和重组大肠杆菌。我们发现Rv1808蛋白与耻垢分枝杆菌细胞壁相关,这说明Rv1808蛋白可能参与宿主细胞相互作用。通过Pull-down发现Rv1808蛋白能够与巨噬细胞TLR-2相互作用。通过ELISA和半定量RT-PCR证明Rv1808蛋白刺激巨噬细胞后能够促进细胞因子TNF-α,IL-6和IL-10的分泌,而不影响IL-1β的分泌。为了证明Rv1808蛋白是否能够特异性增加这些细胞因子的产生。我们分别用蛋白酶处理的Rv1808蛋白和不同浓度的Rv1808蛋白分别刺激巨噬细胞,观察细胞因子的分泌情况。当我们用蛋白酶K处理Rv1808蛋白后刺激巨噬细胞,则不能改变这些细胞因子的产生。同时,我们发现这些细胞因子的产生依赖于Rv1808蛋白的浓度。这说明Rv1808蛋白能够特异性的刺激巨噬细胞分泌细胞因子。为了研究Rv1808蛋白通过影响哪些细胞信号通路促进这些细胞因子的分泌,我们运用一系列细胞信号通路抑制剂处理巨噬细胞后发现NF-κB,ERK1/2,p38和JNK信号途径对于这些细胞因子是必须的。Rv1808蛋白能够增加耻垢分枝杆菌在巨噬细胞中的存活。那么,Rv1808蛋白是通过何种机制得以实现的呢?通过重组菌Ms_Rv1808和Ms_Vec感染巨噬细胞后,用LDH法检测发现Rv1808蛋白不能够加速巨噬细胞的裂解,用Rv1808重组蛋白刺激巨噬细胞后得到相同的结果。当我们用不同浓度的Rv1808蛋白刺激巨噬细胞后,MTT实验证明Rv1808蛋白能够影响巨噬细胞活力。因此,我们猜测Rv1808蛋白可能影响宿主细胞凋亡。总之,我们的结果证明Rv1808蛋白能够调控宿主细胞因子的分泌,从而促进了耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内存活。