DIXDC1是新近克隆的人类Wnt通路的新基因,即ccdl基因(Coiled-coil-DIX1)人类的异构体,ccdl基因在斑马鱼神经管发育过程中被证实是一个Wnt通路的正调控因子。25%左右的人微卫星不稳定性(microsatellite instability)MSI-H的结直肠癌中检测到Wnt通路重要组分Axin2基因突变。上述突变集中于外显子7上的4个单核苷酸连续序列,导致移码和Axin2蛋白C-末端(包括DIX结构域)的缺失,提示Axin2蛋白的C-末端可能参与抑制结直肠癌的发生和发展,然而机制不甚清楚。DIXDC1蛋白就是以Axin2的C-末端为诱饵,通过酵母双杂交实验,筛选出的与Axin2 C-末端存在相互作用的一个蛋白。目前DIXDC1基因全长已经成功地被克隆并制备了相应的抗体,但关于DIXDC1生物化学及细胞生物学的研究报道较少。有研究显示DIXDC1属于actin和tubulin结合蛋白家族的新成员,提示其可能参与对细胞形态和运动的调节。DIXDC1作为Wnt通路的新成员分子,其具体功能怎样,如何通过Wnt通路对于结直肠癌的发生、发展进行调节；其本身是否受到Wnt通路的调节,其调节方式如何；nicroRNA是否也参与调控DIXDC1的表达,与其相关的miRNA与结直肠癌的发生发展关系如何,目前未见国内外报道。本课题从研究DIXDC1的功能为切入点,将首次阐明其在结直肠癌发生发展过程中的生物学作用及机制；并进一步探讨Wnt通路对DIXDC1蛋白表达水平的影响及机制；利用miRNA芯片及生物信息数据库筛选出与DIXDC1存在相互作用的miRNA,进一步验证相关miRNA对DIXDC1表达的调控并探讨相关miRNA对结直肠癌发生发展的影响。为结直肠癌发生发展机制研究提供新的实验依据,为临床结直肠癌的诊断和治疗提供一定的理论基础。目的阐明DIXDC1对大肠癌细胞生物学特性的影响并进一步深入研究其机制。方法脂质体介导的稳定转染方法建立DIXDC1过表达的DLD1细胞；MTT法和裸鼠成瘤实验检测细胞增殖能力；免疫组织化学方法检测DIXDC1在结直肠癌组织中的表达情况及其与增殖指数(Ki-67)的相关性；流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡情况；Western blot检测细胞周期相关蛋白表达水平和PI3K、MAPK信号通路激活状态；双荧光素酶报告系统检测DIXDC1对TCF/LEF转录活性的影响；免疫共沉淀技术验证DIXDC1与Phospho-AKT之间的相互作用；采用PI3K信号通路抑制剂LY294002处理,观察其对DIXDC1过表达细胞生长情况、细胞周期及周期相关蛋白表达的影响；转染DIXDC1 siRNA干扰DIXDC1表达后,观察其对DIXDC1过表达细胞生长情况、细胞周期及周期相关蛋白表达和PI3K信号通路的影响。结果DIXDC1的过表达于体外水平促进大肠癌细胞的增殖,于体内水平促进裸鼠移植瘤形成及生长。与正常肠粘膜相比,结直肠癌组织中DIXDC1蛋白表达水平升高,并且与增殖指数Ki-67的表达具有密切的相关性。DIXDC1通过上调cyclin D1、下调p21蛋白表达进而促进细胞周期G0／G1到S期的转化,且激活PI3K信号通路。同时DIXDC1可以上调β-catenin蛋白表达,并且具有增强TCF/LEF转录活性的作用。通过PI3K信号通路抑制剂作用或者干扰DIXDC1蛋白的表达后,β-catenin和cyclin Dl蛋白表达下调而p21蛋白表达升高,同时阻滞了细胞周期G0／G1到S期的转化。结论DIXDC1具有促进大肠癌细胞增殖和肿瘤形成的作用,其过表达后可以通过上调cyclin D1和下调p21蛋白表达进而促进细胞周期G0／G1到S期的转化,DIXDC1促大肠癌细胞增殖效应可能与PI3K信号通路的激活相关。目的阐明Wnt通路对DIXDC1蛋白表达的调控及其相关机制。方法免疫组织化学方法检测DIXDC1与P-catenin在结直肠癌中共表达及共定位情况；Real-time RT-PCR检测正常肠粘膜、结直肠癌组织及Wnt-3a刺激前后大肠癌细胞中DIXDC1 mRNA表达水平的改变；Western blot检测Wnt-3a刺激后大肠癌细胞中DIXDC1蛋白表达水平的改变；CHX chase assay检测DIXDC1蛋白的半衰期,并观察Wnt-3a对DIXDC1蛋白稳定性的影响；采用MG132处理细胞后应用Western blot检测DIXDC1蛋白表达的改变；免疫沉淀技术检测DIXDC1与泛素蛋白的结合情况,并观察Wnt-3a对DIXDC1蛋白泛素化水平的影响；免疫共沉淀技术检测Wnt-3a对DIXDC1蛋白磷酸化水平的影响。结果结直肠癌组织中DIXDC1与β-catenin存在共表达及共定位情况。与正常组织相比,结直肠癌组织中DIXDC1蛋白表达水平升高但mRNA表达水平却下降。体外实验中Wnt-3a可以诱导DIXDC1蛋白表达水平的升高,但mRNA表达水平却未见升高。Wnt-3a增加DIXDC1蛋白的稳定性,蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,DIXDC1蛋白表达水平升高。Wnt-3a抑制了DIXDC1与泛素蛋白的结合从而增加了DIXDC1蛋白稳定性,同时抑制了DIXDC1蛋白磷酸化水平。结论DIXDC1蛋白是通过蛋白酶体途径降解的,经典Wnt通路的激活可以通过抑制其泛素化而增加DIXDC1蛋白的稳定性；Wnt通路可能通过抑制DIXDC1蛋白的磷酸化水平而影响其泛素化降解。目的筛选并验证与DIXDC1存在相互作用的niRNA,并阐明其对结直肠癌发生发展的影响。方法首先通过一系列重复实验对Agilent公司nicroRNA芯片的稳定性和可靠性进行评估；芯片筛选正常肠粘膜、炎性息肉、肠腺瘤和结直肠癌中差异表达的miRNA;选取芯片检测结果中差异表达的17个miRNA,对14对样本RNA进行Real-tmie RT-PCR检测；运用Significance Analysis of Microarray (SAM)芯片数据分析技术对结直肠癌发生发展各阶段中差异表达的miRNA进行分析；通过TargetScan4.2数据库预测,筛选与DIXDC1存在较为保守的相互作用,且芯片结果中变化较为显著的miRNA;通过双荧光素酶报告系统检测miRNA与DIXDC1 3’UTR区域的结合情况；miRNA寡核苷酸转染实验和Western-blot实验检验miRNA对DIXDC1蛋白表达水平的影响。通过Corrected t test:Bonferroni correction统计分析进一步探讨与DIXDC1相关miRNA对结直肠癌发生发展的影响。结果Agilent公司的microRNA芯片(chip)含有8个独立的阵列(array),阵列内重复检测探针的平均变异系数仅为6.3%,同一芯片内阵列之间的相关性到达0.999,不同芯片之间的相关性也到达0.999,Real-time RT-PCR检测的17个miRNA的差异变化与芯片检测结果的相关性到达0.90。经过SAM分析显示,在正常肠粘膜-炎性息肉与肠腺瘤-结直肠癌中表达存在明显差异的有63个miRNA,其中40个表达升高,23个表达下降；在肠腺瘤与结直肠癌中表达存在明显差异的有38个miRNA,其中11个表达升高,27个表达下降。选择下调表达最明显的miR-195和miR-497进行深入研究,发现miR-195和miR-497均能作用于DIXDC1 3’UTR,进而抑制DIXDC1 mRNA的转录,且均可以抑制DIXDC1蛋白的表达。通过Corrected t test:Bonferroni correction统计分析发现一部分miRNA只在从正常肠粘膜-炎性息肉到肠腺瘤病变过程中存在差异表达；另外一部分miRNA却只在从肠腺瘤到结直肠癌(Dukes’A/B)的病变过程中存在差异表达；而还有一部分miRNA在肠癌发生发展的整个过程中均存在差异表达,即从正常肠粘膜-炎性息肉到肠腺瘤到结直肠癌(Dukes’A/B),miR-195和miR-497在肠癌发生发展的整个过程中均存在差异表达,参与了结直肠癌的发生发展的整个过程。结论在结直肠癌发生发展过程中存在一系列差异表达的microRNA。miR-195和miR-497在肠腺瘤和结直肠癌组织中的表达均显著下调,且与DIXDC1存在相互作用,参与DIXDC1蛋白表达的调节,我们认为DIXDC1、niR-195和miR-497均参与了肠癌的发生发展过程,miR-195和miR-497通过与DIXDC1之间的相互作用间接影响了结直肠癌的发生发展过程。