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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)主要导致母猪的繁殖功能障碍及断奶仔猪的呼吸道症状,PRRS的感染会引起猪只严重的免疫抑制,极易其他病原混合感染后会使得断奶仔猪死亡率会显著上升。该病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起,PRRSV作为RNA病毒其基因组具有极高度的变异概率,这些变异会直接导致毒株间致病力的改变,加剧PRRSV田间流行的复杂性,加大PRRSV的防控难度。在本研究中希望通过对河南地区PRRSV流行毒株的ORF5、Nsp2基因进行遗传变异进化分析、PRRSV流行毒株进行分离鉴定,为进一步了解PRRSV的流行情况、流行毒株遗传变异特点、制定合理的防控措施提供重要的参考依据。ORF5基因编码的GP5蛋白的是PRRSV所有结构蛋白中变异频率最高的部分,由于GP5蛋白既可诱导机体产生高滴度的中和抗体也能诱导非中和抗体,因此ORF5基因的变异与毒株的致病性存在一定的相关性,许多研究者将其常作为重要的靶基因进行PRRSV流行病学调查。在本研究中利用RT-PCR技术对来自河南省各地的152份组织病料和23份血清样品进行PRRSV检测,检测出PRRSV阳性样品17份。对阳性病料样品的ORF5基因进行扩增测序分析发现共获得15个不同的ORF5基因序列,14株全长共603bp编码200个氨基酸,一株全长600bp编码199个氨基酸,对15株流行毒株的核苷酸序列进行比对后发现15株流行毒株之间的核苷酸同源性为81.6%-99.8%。各流行株与以VR2332为代表的美洲型毒株的核苷酸同源性为84.7%-99.8%、与以LV株为代表的欧洲型毒株的同源性只有61.4%-64%,可初步判断15株流行毒株都属于美洲型;各流行株与以VR2332为代表的经典毒株的核苷酸同源性为84.7%-99.8%、与以JXA1为代表的HP-PRRSV的核苷酸同源性为83.7%-99.3%、与以NADC30株为代表的类NADC30毒株核苷酸同源性为83.3%-93.9%。对由ORF5基因推导的GP5蛋白氨基酸序列进行差异位点比较发现,15株流行毒株在诱骗表位26aa-32aa处,中和抗原表位核心区域35aa-42aa处均存在较大的变异:对流行毒株基化位点比较后发现,流行毒株的糖基化位点数目存在增加趋势,而且增加的糖基化位点多在34aa、35aa处,更加靠近GP5蛋白中和抗原表位的核心区域。Nsp2基因编码了 PRRSV全基因组中最大的非结构蛋白Nsp2,Nsp2蛋白也是PRRSV所有蛋白中变异程度最大的部分。由于Nsp2蛋白在病毒增殖、调节宿主免疫应答等方面均发挥着重要的作用,这部分基因的变异与毒株的生物学特性密切相关。在本研究中对17份PRRSV阳性病料样品进行Nsp2基因扩增测序分析发现共获得10个不同的Nsp2基因序列,流行株之间的核苷酸同源性在59.5%-98.2%之间:各流行株与以VR2332为代表的经典毒株的核苷酸同源性为61.6%-99.7%,与以JXA1株为代表的HP-PRRSV的核苷酸同源性为60.7%-77.8%,与以NADC30株为代表的类NADC30毒株核苷酸同源性为62.9%-90.8%。氨基酸差异位点比较发现流行株 HeNan-AY 1、HeNan-AY2、HeNan-BY3、HeNan-JZ23、HeNan-JZ29、HeNan-JZ28、HeNan-RN、HeNan-XX7、HeNan-ZMD 均存在NADC30 株(111+1+19aa)模式的特征性缺失。将17份PRRSV 阳性病料样品,无菌研磨、0.22um滤器滤过处理后接种到Marc-145细胞上,连续盲传三代。HeNan-XX1O、HeNan-JZ2、HeNan-AY1阳性样品传至第三代时均出现细胞病变现象。用RT-PCR和荧光定量PCR检测鉴定病毒增值,结果显示HeNan-XX10、HeNan-JZ2、HeNan-AY1样品的三代细胞均可检测出PRRSV核酸阳性,其病毒载量均大于103拷贝/μL。将这三株流行株的第三代细胞培养物接种到单层PAM细胞上,HeNan-XX10在接种后12 h即开始出现典型细胞病变,HeNan-JZ2、HeNan-AY1在接种48h才出现轻微细胞病变。