第一部分　　Tau+/c1q-/．双转基因小鼠模型的建立　　背景:神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFTs)是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的主要病理学特征之一。NFTs的主要成分是异常过度磷酸化的Tau蛋白。Tau蛋白是一种广泛分布在中枢神经系统细胞内的重要的微管相关蛋白，与微管共同构成细胞骨架结构，其生理功能主要为诱导与促进微管蛋白聚合成微管并防止微管解聚以及维持微管结构与功能的稳定。当Tau蛋白在各种情况下出现异常过度磷酸化等修饰，将失去对微管的稳定作用，进而导致神经退行性变。AD的发病机制目前尚不清楚。近年来随着研究的不断深入，发现由神经胶质细胞主导的颅内慢性炎性反应在AD发病过程中起了重要作用。补体系统是机体体液免疫的重要组成部分，也参与了上述炎性反应。补体(complement，C)是存在于正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质，主要由肝脏产生。目前已知补体是由30余种可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体组成的多分子系统，故称为补体系统(complementsystem)，主要有经典途径、凝集素途径、替代途径等三种激活途径。根据补体系统各成分的生物学功能，可分为补体激活的固有成分、补体的调节成分以及补体受体(CR)，其中大部分是分子量较大的蛋白。一般情况下，血液中的补体成分无法通过血脑屏障(Bloodbrain barrier，BBB)。研究表明脑内补体由神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞以及内皮细胞等产生。目前发现颅内细胞产生的补体与AD发病密切相关。在AD患者大脑中，研究者发现补体经典途径早期成分C1、C2、C4等和补体活化最终形成的攻膜复合体(MAC)的表达。除经典途径外，Strohmeyer等人发现补体的替代通路也与AD的病理损害相关。Lanzrein等人在AD患者与正常对照组外周血清中，发现甘露聚糖结合凝集素并未有显著差异，但是在脑脊液中，AD患者甘露聚糖结合凝集素却有明显降低，支持凝集素途径也参与AD的发病。然而补体各成分在AD发病中所起作用目前仍不甚清楚。c1q是构成补体经典途径第一成分C1的重要成分。c1q与免疫复合物结合，即可启动补体经典通路的活化。近年来对补体c1q的研究发现其在AD发病中可能起着多种作用。部分学者认为c1q在AD发病中起着毒性作用:c1q通过与Aβ多价结合，促进老年斑的成核过程。而部分学者则认为c1q具有保护作用，Pisalyaput等通过体外实验证实c1q可以增强小胶质细胞吞噬Aβ，可以保护神经元免受Aβ所致神经毒性。但是目前国内外尚无关于c1q蛋白影响Tau蛋白的研究。B6C3-Tg(Prnp-MAPT*P301S)PS19小鼠系为过表达人类MAPT基因（Tau蛋白的编码基因）P301S突变的转基因小鼠，在6个月龄时病理学上即出现双螺旋细丝(PHF)、突触蛋白的丢失以及小胶质细胞的活化，9个月龄时出现神经原纤维缠结(NFTs)以及海马体积的缩小，是目前研究Tau蛋白病的理想动物模型。c1q-/-小鼠系为c1qA链敲除小鼠系，广泛用于c1q的相关研究中。为了探讨c1q蛋白对Tau蛋白的影响及其机制，本课题拟首先建立Tau+/c1q-/-双转基因小鼠模型。　　目的:建立Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠模型，为探讨c1q蛋白对Tau蛋白的影响及其机制研究提供实验基础。　　方法:分别传代培养B6C3-Tg(Pmp-MAPT*P301 S)PS19小鼠系与c1q-/-小鼠系，至4月龄时将Tau+小鼠与c1q-/-小鼠杂交，子代小鼠进行基因型鉴定获得c1q+/-、Tau+/c1q+/-两种基因型小鼠;第一代小鼠长至4月龄时将c1q+/-、Tau+/c1 q+/-两种基因型小鼠再次杂交传代，第二代小鼠行基因型鉴定。　　结果:第一代小鼠经基因型鉴定获得c1q+/-、Tau+/c1 q+/-两种基因型小鼠;对第二代小鼠基因型分析，最终得到c1q+/+、c1q+/-、c1q-A、Tau+/c1 q+/+、Tau+/c1 q+/-、Tau+/c1 q-/-六种基因型小鼠。选取同代、具有相同遗传背景的以下三种基因型小鼠作为实验组及对照组进行后续实验:c1q+/+(WT)、Tau+/c1 q+/+(Tau+)、Tau+/c1q-/-。　　结论:成功构建Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠模型，并获得足够数量的实验组及对照组小鼠。　　第二部分　　Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠脑内磷酸化Tau蛋白表达检测　　背景:神经细胞内的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFTs)和神经细胞外的老年斑(senile plaques，SPs)的形成是AD的两个重要的神经病理学特征。异常过度磷酸化的Tau蛋白是神经原纤维缠结的重要组成部分。Tau蛋白的主要功能有:促进微管形成和保持微管稳定性。Tau蛋白的功能受其磷酸化状态调节。Tau蛋白过度磷酸化后，改变了Tau蛋白的构象，导致正常情况下具有的促进管蛋白聚合成微管和稳定微管的作用丧失，从而引起微管的解聚、细胞骨架的破坏，因此Tau蛋白过度磷酸化是AD的重要病理变化之一，可能是其发病机制中的一个核心环节。　　目的:本章工作拟在前期成功构建Tau+/c1q-/-双转基因小鼠模型的基础上，探讨c1q敲除对Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠脑内Tau蛋白磷酸化的影响。　　方法:用免疫印迹(Western blot)的方法检测实验组及对照组小鼠大脑皮层磷酸化Tau蛋白的表达。　　结果:在3月龄Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠大脑皮层磷酸化Tau蛋白（PHF1）的表达相对于对照组Tau转基因小鼠即有减少的趋势。在6月龄小鼠组中发现，Tau+/c1q-/-双转基因小鼠大脑皮层磷酸化Tau蛋白(PHF1、PHF6、PHF13、p-Tau ser396、CP13、AT8)的表达相对于对照组Tau转基因小鼠磷酸化Tau蛋白的表达均具有明显减少。更进一步研究发现，在10月龄Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠大脑皮层磷酸化Tau蛋白(PHF1、PHF6、PHF13、p-Tauser396、CP13、AT8)的表达相对于对照组Tau转基因小鼠磷酸化Tau蛋白表达减少更加明显。　　结论:c1q敲除可以显著减少6月龄及10月龄Tau+/c1q-/-双转基因小鼠大脑皮层Tau蛋白的磷酸化。　　第三部分　　Tau+/c1q-/-双转基因小鼠海马组织突触蛋白表达检测　　背景:突触受损是AD早期的病理变化之一。在轻度认知功能障碍(MCI)患者中即可观察到海马突触数量减少。突触减少与神经元丧失不成比例，而与痴呆的严重程度密切相关。　　目的:本章工作拟在前期发现c1q敲除可以显著减少10月龄Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠大脑皮层磷酸化Tau蛋白表达的基础上，进一步探讨c1q敲除对Tau+/c1q-/-双转基因小鼠海马组织突触蛋白表达的影响。　　方法:用免疫印迹(Western blot)的方法检测Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠及对照组小鼠海马区突触前膜蛋白(SYP、SNAP25)、突触后膜蛋白（GluR1、NMDAR1、PSD95）的表达。　　结果:在10月龄Tau+转基因小鼠中SYP、SNAP25蛋白均较WT小鼠蛋白表达减少，而Tau+/C1q-/-双转基因小鼠相对于Tau转基因小鼠SYP、SNAP25蛋白的表达均可见明显恢复，但仍少于WT小鼠。对突触后膜蛋白（GluR1、NMDAR1、PSD95）的研究未发现明显改变。　　结论:c1q敲除可以保护10月龄Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠海马组织突触蛋白。　　第四部分　　Tau+/c1q-/-双转基因小鼠神经病理学特征检测　　背景:AD病理学上以β淀粉样蛋白(Aβ)沉淀形成的老年斑(SP)，神经元内Tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结(NFT)，皮质、海马神经元及其突触数量减少以及神经胶质细胞反应性增生为特点。前期工作中我们发现c1q敲除可以显著减少Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠大脑皮层Tau蛋白的磷酸化，进一步的研究发现c1q敲除可以保护Tau+/c1q-/-双转基因小鼠海马组织突触蛋白。因此我们提出疑问:c1q敲除在神经病理学上是否可以保护Tau+/c1q-/-双转基因小鼠的神经退行性变。　　目的:在本章工作中，我们主要探讨c1q敲除对Tau+/c1q-/-双转基因小鼠神经病理学变化的影响。　　方法:本章工作主要从小鼠脑内磷酸化Tau蛋白表达、神经原纤维缠结(NFT)数量、神经胶质细胞增生程度等三个方面，利用免疫组化的方法评价c1q敲除对Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠病理学特征改变的影响。　　结果:c1q敲除后相对于对照组Tau+转基因小鼠，Tau+/c1q-/-双转基因小鼠病理学上磷酸化Tau蛋白表达、神经原纤维缠结(NFT)数量、神经胶质细胞增生程度等三方面均明显减少或程度减轻。　　结论:本章工作从神经病理学上证实c1q敲除可以保护Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠的神经退行性变。　　第五部分　　Tau+/c1q-/-双转基因小鼠行为学观测　　背景:高度特异性的动物模型是研究AD发病机制及开发有效防治药物的先决条件，理想的AD动物模型是在动物身上同时复制出其主要神经病理变化（神经原纤维缠结和老年斑）并使之出现相应的行为学改变（如记忆的损害）等。学习和记忆是脑的最高级机能-智能的重要组成部分。学习是指经验（行为习惯、感知、思维）的获得或发展，记忆则指经验的保存和再现，它们是两个不同而又密切联系的神经生物过程，是行为的组成部分，而人与动物的行为是在中枢神经系统控制下的极其复杂的过程。人们通过各种实验方法来分析这一复杂过程。Barnes maze test（Barnes迷宫）是一种较好的评定动物空间学习和记忆能力的方法。Rotarod test（旋转杆实验）能对动物的运动及协调能力进行评价。　　目的:本章工作中我们采用Barnes maze test（Barnes迷宫）及Rotarod test（旋转杆实验）这两种行为学检测方法，观察动物在特定环境下的行为表现，分析Tau+/c1q-/-双转基因小鼠的学习与记忆能力及运动能力，进一步从行为学上探讨c1q敲除对Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠的学习、记忆及运动能力的影响。　　方法:Barnes迷宫及Rotarod旋转杆实验。　　结果:Barnes迷宫实验发现:相对于对照组Tau+转基因小鼠，Tau+/c1q-/-双转基因小鼠的短期及长期记忆能力均有明显改善，而学习能力无明显差异。Rotarod旋转杆实验发现Tau+转基因小鼠与Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠在运动能力方面无显著差异。　　结论:c1q敲除可以显著改善Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠的短期及长期记忆能力，而对学习及运动能力无明显改变。　　第六部分　　c1q影响Tau蛋白磷酸化的分子机制研究　　背景:Tau蛋白过度磷酸化是由体内蛋白激酶引起。蛋白激酶根据催化磷酸化反应的特点，可分为脯氨酸指导的蛋白激酶(proline directed protein kinase，PDPK)，包括糖元合成酶激酶-3(glycogen synth ase kinase-3，GSK-3β)、细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin dependent kinase-5，CDK5)、丝裂原激活的蛋白激酶(miotgen activated protein kinase，MAPK)和非脯氨酸指导的蛋白激酶(non-proline directed protein kinase，non-PDPK)，包括微管结合调节激酶(microtubule affinity regulating kinase，MARK)、蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)、钙调蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）。　　目的:在本课题前期工作中我们发现c1q敲除可以显著减少Tau+/c1q-/-双转基因小鼠Tau蛋白的磷酸化。在本章工作中，我们主要来探讨c1q影响Tau蛋白磷酸化的可能分子机制。　　方法:用免疫印迹(Western blot)的方法检测Tau+/c1q-/-双转基因小鼠及对照组小鼠大脑皮层ERK1/2、P38、JNK、CDK5、GSK-3β、CaMKⅡ、PKA、PKC、GSK-3α、CREB等蛋白激酶及其磷酸化形式的表达;用酶联免疫吸附实验(ELISA)的方法检测Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠及对照组小鼠大脑皮层PKA活性、cAMP水平。　　结果:与Tau+转基因小鼠相比较，Tau+/c1q-/-双转基因小鼠大脑皮层CDK5、ERK、p38、JNK、PKC、CaMKⅡ等激酶的磷酸化形式表达量无明显变化，而GSK3β、PKA等激酶的磷酸化形式明显减低。通过ELISA的方法我们发现相对于Tau+转基因小鼠，Tau+/c1 q-/-双转基因小鼠PKA激酶活性及cAMP水平均显著降低，表明cAMP-PKA通路在c1q影响Tau蛋白磷酸化的分子机制中起着重要作用。　　结论:cAMP-PKA通路在c1q影响Tau蛋白磷酸化的分子机制中起着重要作用。　　第七部分　　c1q影响Tau蛋白磷酸化的体外研究　　背景:在本课题前期工作中，我们建立了Tau+/c1q-/-双转基因小鼠模型，利用Western blot和免疫组织化学等方法证实c1q敲除可以显著减少Tau+/c1q-/-小鼠体内磷酸化Tau蛋白的表达，保护Tau+/c1q-/-小鼠海马突触蛋白，改善Tau+/c1 q-/-小鼠的学习与记忆能力。　　目的:在本章工作中我们主要探讨在体外过表达c1q是否可以促进细胞内Tau蛋白的磷酸化。　　方法:利用SH-SY5Y细胞模型进行人wild type Tau441(pCDNA3.1+)质粒与c1qA(pCMV6-AC)质粒共转染，采用免疫印迹(western blot)的方法检测实验组及对照组磷酸化Tau蛋白的表达。　　结果:与对照组相比，Tau与c1qA共转染SH-SY5Y细胞组细胞内磷酸化Tau蛋白PHF1、PHF13、CP13的表达量均明显增加，而总Tau蛋白(DA9)无明显差异。　　结论:体外过表达c1q可以促进Tau蛋白的磷酸化。