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目的： 内吞作用,是指细胞外物质,通过膜凹陷包裹转运到细胞内,完成各种生命过程.内吞隔间是由大量的管泡网格组成的复杂的异构细胞器,从细胞膜表面延伸至细胞核的区域.只有内吞的营养物质、代谢物、激素和生长因子才能进行摄入、分选,除此之外,内吞还能维持极性细胞的血浆膜功能结构域的分布和受体与配体循环.受体-配体复合物内吞后,部分受体从早期内体循环回到膜表面,还有一些受体被转运到晚期内体/溶酶体进行降解.泛素分子是受体在胞内体分选到不同途径的信号,而泛素信号的识别依靠转运必需内体复合物(ESCRT),被分选出来的泛素化受体进入多泡体(MVB)通路,随后转运到晚期内体/溶酶体降解,使细胞信号下调. Tom1L1作为Src家族蛋白激酶的底物,参与EGF受体的内吞、胞内分选和信号转导.已有研究证明EGF刺激Src家族,Tom1L1发生磷酸化,在Grb2作用下使Tom1L1与EGF结合,使Tom1L1从细胞质富集到质膜上并与EGFR共同进入早期胞内体.Tom1L1的突变体能够抑制EGFR的内吞,表明在内吞和胞内体分选中Tom1L1的起着不可或缺的作用.但Tom1L1是如何参与ESCRT还没有得到明确阐释,所以本实验首先构建Transferrin receptor-Ubiquitin载体作为胞内体标记物,研究Tom1L1与ESCRT及相关亚基对蛋白分选的作用;观察Tom1L1对蛋白胞内体分选、降解途径和MVB形成进程的影响.为许多疾病发生机制提供分子病理基础,也为临床治疗策略提供新思路. 方法： 1.构建转铁蛋白受体-泛素、Tom1L1基因载体 采用PCR扩增小鼠泛素基因、人转铁蛋白受体基因和鼠Tom1L1基因,经双酶切,将表达载体pCI-neo-HA与基因相连接,测序,提质粒. 2.Transferrin receptor-Ubiquitin、Tom1L1载体的表达及鉴定 将提取的Transferrin receptor-Ubiquitin、Tom1L1质粒转染到A431细胞,过夜培养,裂解细胞,western blot检测蛋白表达. 3.免疫荧光检测Transferrin receptor-Ubiquitin 在稳定表达转铁蛋白受体-泛素的A431细胞中,用Tf刺激,免疫荧光显微镜观察不同时间段Transferrin receptor-Ubiquitin定位情况. 4.研究Transferrin receptor-Ubiquitin和Tom1L1的关系 在A431稳定细胞株中过度表达Tom1L1时,转铁蛋白刺激,免疫荧光显微镜观察Transferrin receptor-Ubiquitin与Tom1L1的定位情况.在Tom1L1敲减的A431细胞中,转铁蛋白刺激,免疫荧光显微镜观察Transferrin receptor-Ubiquiti n定位情况. 5.Hrs对Transferrin receptor-Ubiquitin和Tom1L1的影响 在Hrs过表达的A431细胞中,免疫荧光检测Tom1L1的表达;在Hrs敲减的鼠MEF细胞中,免疫荧光检测Transferrin receptor-Ubiquitin和Tom1L1的表达. 结果： 1.Transferrin receptor-Ubiquitin、Tom1L1载体的构建、表达和鉴定 通过设计特异性引物,经PCR扩增得到泛素、转铁蛋白受体和Tom1L1片段.产物纯化,载体质粒pCI-neo-HA酶切后,与基因片段连接,测序.测序正确者,对A431细胞进行转染,细胞裂解,离心获取裂解液.进行Western Blot鉴定,细胞表达的转铁蛋白受体-泛素蛋白分子量大小为100KDa,Tom1L1蛋白分子量为55KDa,表明载体构建成功. 2.Transferrin receptor-Ubiquitin在细胞中的定位 通过免疫荧光实验,结果显示在细胞表面并未检测到转铁蛋白受体-泛素,而是在内吞后进入胞内小体,并始终存在于细胞内. 3.Transferrin receptor-Ubiquitin和Tom1L1的关系 通过免疫荧光实验结果表明Tom1L1与Transferrin receptor-Ubiquitin共定位胞内体,并且对Tom1L1进行敲减,可以影响Transferrin receptor-Ubiquitin定位到胞内体. 4.Hrs对Transferrin receptor-Ubiquitin和Tom1L1的影响 在Hrs过表达的A431细胞中,Tom1L1被吸引到胞内体上.在Hrs敲除的鼠MEF细胞系统中,Transferrin receptor-Ubiquitin定位的胞内体(body structure)数量变少,体积变大,而且这时Tom1L1不再被吸引到胞内体上. 结论： 1.TfR-Ubi为进一步研究ESCRT胞内体分选过程及为接下来机制研究提供实验工具. 2.TfR-Ubi定位到胞内体依赖于Tom1L1和Hrs的相互作用. 3.Tom1L1只有在Hrs存在的情况下才能参与蛋白胞内体分选.