论文部分内容阅读
研究目的寻常痤疮是青少年中最常见的炎症性毛囊皮脂腺单位疾病,严重者导致损容,致郁,甚至自杀倾向。DNA甲基化参与慢性炎症性疾病的发病,国内外尚未见到有关痤疮患者DNA甲基化的研究报道。通过对中重度痤疮患者全基因组DNA异常甲基化筛查,初步明确异常DNA甲基化位点及甲基化程度,为进一步构建痤疮患者甲基化图谱奠定基础,为阐明痤疮的遗传学机制积累资料。研究方法1、选取4例南方医科大学深圳医院门诊就诊且具有家族史的中重度寻常痤疮患者的背部皮损组织与外周血,以2例健康人背部皮肤组织为对照,将患者皮损组织、外周血与健康对照者皮肤标本进行配对。2、采用DNA提取试剂盒提取皮肤组织及外周血样本全基因组DNA。用紫外分光光度仪检测DNA浓度及纯度,1.25%琼脂凝胶电泳检测DNA完整性(OD260/OD280在1.7~2.0之间,总量>1μg,浓度>50 ng/μL,DNA条带清晰,无弥散杂带,为合格DNA),-80℃保存备用。3、重亚硫酸氢盐处理:使用EpiTect Bisulfite Kit重亚硫酸盐转换试剂盒,对DNA样本进行重亚硫酸盐处理,修饰DNA CpG岛。每个样品DNA处理总量为1μg,最多可以满足200个候选区域片段测序检测。4、全基因组扩增、杂交、扫描:对经过重亚硫酸盐处理后的样本进行全基因组的扩增和杂交;用PCR纯化试剂盒对处理后的样本进行纯化。5、全基因组DNA甲基化位点筛选:应用Il umina Infinium Methylation EPIC BeadChip芯片技术获得DNA甲基化信号。应用聚类分析、GO分析、KEGG分析进行信号采集与芯片结果分析。将得到的DNA甲基化比例背景数值与甲基化芯片内置的标准对照位点对比并矫正。研究结果病例组与皮肤对照组共计67984个CpG位点在甲基化水平上存在差异,甲基化水平增高的位点共30621个,甲基化水平降低的位点共37363个。与差异甲基化位点相对应的基因数目共4635个,甲基化水平增高的基因有2284个,甲基化水平降低的基因共2351个,GO功能富集分析分别列出位于前10的基因功能类别条目。KEGG通路富集分析显示差异甲基化基因主要富集于炎症、性激素、癌症等信号通路。研究结论AV患者的皮肤组织存在DNA异常甲基化特异基因,DNA异常甲基化可能是AV发病中的原因之一,是表观遗传学调控痤疮发病的主要方式;本研究使用Ilumina Infinium Methylation EPIC BeadChip芯片技术初步建立了AV皮肤组织基因组DNA甲基化图谱,并初步了解了这些基因的功能和信号通路,为寻常痤疮的表观遗传发病机制及治疗、预防奠定基础。