现有对冠状病毒科的研究显示,该科病毒拥有相对复杂的基因组结构(29~31kb),含有多个独立基因.病毒粒子包含3-4种结构蛋白.SARS-CoV病毒的结构蛋白主要有S、M、E、N 4种.其中S、M和E作为膜结合型结构蛋白,由于相对暴露于病毒分子表面,可作为主要的疫苗设计靶点.我们通过数据库结合软件分析的方法,选择了位于该病毒膜蛋白非保守区的多个表位,构建了多抗原表位融合的SARS-CoV基因疫苗.该多抗原表位融合蛋白首先被证明可在原核和真核细胞内有效表达;进而,基因免疫和基因蛋白复合免疫表明,该疫苗可诱导有效的体液免疫反应及相应的细胞免疫应答;所诱导的抗血清可特异性的结合真核或原核表达的病毒蛋白及病毒裂解液中相应蛋白;中和试验表明,抗血清可一定程度的控制病毒感染造成的细胞病变水平.1.基于多抗原表位的SARS-CoV基因疫苗的分子设计:由于S、M蛋白是SARS冠状病毒的主要膜结构蛋白,在该病毒感染过程中起关键作用,因此,我们将这两个蛋白作为分析的靶蛋白.通过BLAST网络数据库分析该病毒的S基因全长序列表明S蛋白1-217aa及425-513aa为该病毒特异的非保守区,运用DNAstar生物软件分析,通过可及性、抗原性等参数的分析,结合已有的研究成果,进一步选择各类参数均较好的结构区域作为候选疫苗表位区段;通过网络数据库分析确定这些区段中可能存在的T细胞抗原表位;最后结合上述数据,预测同时具有T,B细胞表位的理想短肽为疫苗表位.分析现有的各种连接序列,并优化串联顺序,获得基于表位的SARS-CoV多价疫苗的氨基酸设计序列.为了增强基因疫苗载体内的表达效果,我们又对相应基因的密码子进行了优化,使之适于在真核细胞内表达,从而最终获得基于表位的SARS-CoV基因疫苗的核酸设计序列.2.多抗原表位SARS-CoV疫苗的原核表达及其免疫原性研究:为了解该多抗原表位融合分子的免疫原性,研究该融合分子在原核表达系统的表达效率并获得检测用蛋白,我们将体外合成和构建的多表位串联基因片段接入pET-32a,结果表明,该多抗原表位串联基因可在原核细胞内高效表达.以所得蛋白混合完全弗氏佐剂免疫小鼠,三周左右即可检测到特异性抗体的产生.3.多抗原表位SARS-CoV基因疫苗的构建及其诱导的特异性免疫应答:将该多抗原表位串联基因片段接入pcDNA4-his/myc载体,研究该设计基因的真核表达特性.pcDNA4-his/myc-epis转染293T细胞后,Western-blot和免疫荧光检测证明,该融合表位蛋白可在真核细胞内有效表达;体内肌注该质粒36h后也可观察到体内多表位融合分子的产生,这表明该多抗原表位串联分子可用于进一步的基因疫苗研制.4.多抗原表位SARS-CoV基因疫苗抗病毒特性的研究:多抗原表位的SARS-CoV疫苗诱导的抗血清对真核、原核和病毒裂解液的杂交试验表明,该疫苗可同时诱生针对SARS-CoV结构蛋白M、S特异的抗体.中和试验表明,抗血清可以一定程度的控制病毒感染的细胞病变水平,维持细胞形态,抑制细胞死亡.该研究通过网络数据库比对结合软件分析,设计了对应的多抗原表位融合的新型候选疫苗.通过基因免疫和基因蛋白复合免疫两种方法,证明多抗原表位的SARS-CoV基因疫苗可有效诱导体液和细胞免疫反应,产生的抗体可与原核或真核表达的蛋白特异性的反应,也可与SARS-CoV病毒裂解液中S蛋白特异结合,并能一定程度上抑制病毒造成的病理改变.