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目的:本项目分别使用不同的钙离子通道抑制剂工具药和构建CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞模型(CAPNS1-/-)来研究calpain在三邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP）引起SK-N-SH细胞自噬紊乱中的调节作用及机制。方法:1.利用CRISPR/Cas9技术构建CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系(CAPNS1-/-)。2.MTT法检测TOCP（0、0.25、0.5、0.75、1 mmol/L）对野生型SK-N-SH细胞(CAPNS1+/+)和突变型SK-N-SH细胞(CAPNS1-/-)增殖的影响,确定TOCP使用浓度。3.SK-N-SH细胞经Verapamil、2-APB、CsA预处理后,0.75mmol/L TOCP染毒,使用荧光分光光度计检测细胞内钙离子浓度变化和calpain活性变化,并用Western-blotting检测细胞中calpain和自噬相关蛋白水平。4.野生型SK-N-SH细胞(CAPNS1+/+)和突变型SK-N-SH细胞(CAPNS1-/-)经0.75 mmol/L TOCP染毒后,荧光分光光度计检测calpain活性和proteasome活性变化,Western-blotting检测calpain蛋白、自噬相关蛋白、细胞骨架蛋白及磷酸化蛋白及Ub蛋白水平。结果:1.利用CRISPR/Cas9技术构建CAPNS1-/-SK-N-SH细胞,经基因测序表明CAPNS1-/-SK-N-SH细胞系构建成功,并且CAPNS1蛋白、calpain1和calpain2蛋白水平明显降低。2.MTT检测显示,TOCP分别处理SK-N-SH细胞和CAPNS1-/-SK-N-SH细胞48小时后,细胞增殖受到明显抑制。3.TOCP能使SK-N-SH细胞中钙离子浓度和calpain活性增加;用Verapamil、2-APB和CsA预处理后再经TOCP染毒,发现三种抑制剂能够抑制TOCP所诱导的细胞内钙离子浓度和calpain活性上升趋势。同时,Western-blotting结果显示,TOCP能使细胞内calpain1、calpain2、LC3Ⅱ、P62水平增加;而使用三种抑制剂预处理后TOCP所诱导的calpain1、calpain2、LC3Ⅱ、P62蛋白水平上升趋势受到抑制。另外,与TOCP处理CAPNS1+/+SK-N-SH细胞组相比,TOCP染毒CAPNS1-/-SK-N-SH细胞后,细胞中calpain活性、calpain1和calpain2水平下降;同样LC3Ⅱ和P62水平降低,而beclin1水平增加。4.TOCP处理能使两种细胞中Tau、P-Tau、NF-H、MAP2水平下降,P-MAP2、P-NF-H水平上升;与CAPNS1+/+SK-N-SH细胞相比,CAPNS1-/-SK-N-SH细胞中NF-H和MAP2水平上升,P-MAP2、P-NF-H水平下降,但Tau、P-Tau水平无明显变化。此外,TOCP处理能够抑制两种细胞proteasome（PGPH-L）活性,Ub蛋白水平增加;但与CAPNS1+/+SK-N-SH细胞相比,CAPNS1-/-SK-N-SH细胞proteasome（PGPH-L）活性升高,Ub蛋白水平下降。结论:1.TOCP能够通过激活L-型钙离子通道、线粒体钙离子通道和内质网IP3R钙离子通道使SK-N-SH细胞内Ca2+浓度、calpain活性及表达增加升高;2.TOCP能够使SK-N-SH细胞中beclin1水平下降,LC3-II和P62水平上升;自噬受体蛋白OPTN水平下降,NBR1水平上升,抑制细胞自噬;3.TOCP可通过激活calpain活性从而诱导SK-N-SH细胞中骨架相关蛋白Tau、MAP2、NF-H降解。4.TOCP能使SK-N-SH细胞中Proteasome活性降低,泛素化蛋白积聚。