研究背景胃癌是世界五大常见肿瘤之一,其致死率位列第三[1-3]。在东亚地区,胃癌是发病率最高的癌症之一,每年约有70%的胃癌新发病例和死亡发生在东亚、东欧和南美,而中国就占到所有人数的42%[4-6]。中国是胃癌高发国家,胃癌在中国男性人群中的发病率仅次于肺癌,位列第二,在中国女性人群中居第四位[2]。近年来,随着人们卫生条件的提高和饮食习惯的改善,胃癌的发病率有下降的趋势,但是由于胃癌具有高转移和高复发率等特点,导致其生存预后情况差异很大,晚期胃癌的5年生存率仍低于20%。针对胃癌的传统治疗方法,如手术、放疗、化疗并未明显改善胃癌病人的预后,因此迫切需要创新肿瘤治疗手段。研究表明,一些基因可能对胃癌的侵袭转移具有调控作用[7],针对这些基因的靶向治疗取得了一些进步,但是由于肿瘤形成的异质性,多种基因间的相互作用,以及靶向药物载体的局限等原因,导致胃癌的靶向治疗效果不佳。因此,迫切需要寻找新的治疗靶点,为胃癌发生发展、侵袭转移机制的深入研究以及精准医疗提供可靠的理论依据。人滋养层细胞表面抗原 2(human trophoblast cell surface antigen 2,TACSTD2/Trop2/M1S1/GA733-1),位于染色体 1q32[8]。Trop2 最早发现在人滋养层细胞表面[9,10],是单跨膜蛋白,约36kDa,分为膜外区、跨膜区、膜内区和一个磷酸化的胞质尾[11]。Trop2能够被肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)转化酶裂解为胞外域和胞内域,胞内域从跨膜区离开后直接进入胞浆或核内从而发挥生物学作用[12]。Trop2主要在上皮组织肿瘤中高表达,并能够促进肿瘤的恶性生物学行为[13]。本实验室自2009开始对Trop2基因进行研究,前期的实验表明,Trop2基因在乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌中高表达,但是关于TroP2基因对胃癌的影响尚未见报道。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)现象是指上皮细胞在正常生理和特定病理条件下向间充质细胞转化的现象[14],在肿瘤转移过程中发挥关键作用[15],将肿瘤细胞重新编程,使其具有干细胞特性[16-18]。为了适应肿瘤微环境的变化,在肿瘤发生转移的早期,肿瘤细胞就会发生很多表型的改变[19]。而正常的上皮组织多层细胞结构不利于恶性肿瘤细胞的迁移与侵袭,肿瘤细胞为了获得运动能力就要通过发生EMT变化而失去上皮表型(细胞间粘附、基顶极性以及非移动性)和上皮细胞的表面标志物,如E-钙黏附蛋白(E-cadherin),并得到间质表型(可移动性、侵袭能力以及抗凋亡能力)和间质细胞的表面标志物,如纤维连接蛋白(fibronectin)、波形蛋白(vimentin)等[20-22]。因此,EMT现象在肿瘤转移的早期出现是非常重要和必不可少的。本课题首先应用免疫组化技术,通过830例临床胃癌组织芯片分析Trop2与临床病理因素、预后的相关性,评价Trop2作为胃癌靶向治疗分子靶点的可行性;在第二部分的研究中我们分别从体内和体外实验探讨TroP2对胃癌恶性生物学行为的影响,发现Trop2在胃癌上具有促进胃癌细胞增殖,抑制凋亡,并能促进胃癌细胞的迁移和侵袭能力;最后我们通过临床标本和动物实验证实Trop2的表达和间质细胞表面标志物vimentin的表达相关联,进而利用体外实验阐明Trop2能够介导β-catenin促进vimentin的表达,从而诱导胃癌EMT现象及侵袭转移的分子机制。研究目的1.从胃癌临床标本、细胞学实验和动物实验三个层次研究Trop2对胃癌恶性生物学行为的影响和Trop2作为胃癌新靶点的可行性。2.阐明Trop2可能通过调控β-catenin促进vimentin的表达,从而诱导胃癌EMT现象和侵袭转移的分子机制。研究方法1.选择41对胃癌组织和癌旁组织新鲜标本,实时定量RT-PCR检测Trop2 mRNA的表达水平;用免疫组化方法检测Trop2在830例胃癌组织芯片中的表达情况,并结合临床病理资料分析其临床意义,探讨Trop2的表达与胃癌临床病理分期、预后等的关系。2.选择Trop2高表达和低表达各两株胃癌细胞系,分别敲减和过表达Trop2,CCK8法和平板克隆实验检测胃癌细胞增殖,FACS检测细胞凋亡和细胞周期,Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力变化。分别选用shRNA-NC和shRNA-Trop2稳转胃癌细胞株,制备裸鼠皮下成瘤模型,通过测量瘤体积和瘤重,比较Trop2敲减后对胃癌的抑制作用。3.免疫组化检测EMT表面标志物vimentin和Trop2在248例人胃癌组织及86例癌旁组织中的表达情况,分析两个基因表达的关联,以及与胃癌转移、生存预后等的相关性。4.检测过表达或敲减Trop2后胃癌细胞上EMT表面标志物(E-cadherin,vimentin 和 fibronectin)及 p-catenin、goocecoid、snail 等 EMT 转录因子的表达变化;TGF-β1诱导胃癌细胞株EMT模型,检测EMT模型中Trop2和EMT转录因子的表达变化;免疫共沉淀实验检测Trop2和p-catenin间的相互作用;同时检测Trop2,β-catenin,vimentin在胃癌细胞株,EMT模型细胞株,敲除Trop2的EMT模型细胞株上表达情况;激光共聚焦显微镜观察β-catenin、vimentin在过表达/敲减Trop2胃癌细胞株、EMT模型细胞株上敲除Trop2后的表达变化情况,分析TroP2对胃癌侵袭转移的作用机制。5.分别选用shRNA-NC和shRNA-Trop2稳转胃癌细胞株,注射裸鼠尾静脉制备转移瘤模型,5周后处死裸鼠,分离出肺组织,比较组别间肺组织的重量和转移瘤的数量,IHC检测肺组织转移瘤的Trop2、ki67、vimentin表达情况,分析Trop2对胃癌细胞转移能力的影响。研究结果1.实时定量RT-PCR检测41对人胃癌新鲜标本和癌旁组织,结果显示Trop2 mRNA在胃癌组织中的表达比癌旁组织高2.32±1.44倍;免疫组化检测830例不同类型的人胃癌组织芯片,结果显示,TroP2在胃癌组织中阳性表达率高于癌旁组织、慢性胃炎组织、低级别瘤变和高级别瘤变;胃癌中Trop2的表达与胃癌分化程度、TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、幽门螺旋杆菌感染等相关,Trop2高表达预示着胃癌病人的预后不良,提示Trop2可以作为一个新的胃癌分子靶点。2.细胞实验结果显示,TroP2能促进胃癌细胞的增殖能力和克隆形成能力,并能减少胃癌细胞的凋亡数量;过表达Trop2后,胃癌细胞的迁移、侵袭能力增强,敲减Trop2能抑制胃癌细胞的迁移、侵袭能力;Trop2促进胃癌细胞周期中S期所占比例明显增多。动物实验结果发现,敲减Trop2在体内能明显抑制肿瘤的增殖能力,抑瘤率达到50.40%。免疫组化结果显示,和空载对照组的肿瘤组织相比,shRNA-Trop2组的肿瘤组织中Trop2表达量相对较低。结果提示Trop2对胃癌细胞的恶性生物学行为具有促进作用。3.免疫组化检测248例胃癌组织及86例癌旁组织中Trop2和vimentin的表达水平。结果显示,Trop2和vimentin的表达呈正相关,Trop2和vimentin在胃癌组织中阳性表达率高于癌旁组织;胃癌组织中TroP2+/vimentin+表达和分化、TNM分期、远处转移等相关,Trop2+/vimentin+预示着胃癌病人的预后不良,提示胃癌中TroP2的表达可能和胃癌EMT现象有关。4.细胞水平实验结果显示,western-blot和实时定量RT-PCR检测结果显示,Trop2可上调间质细胞表型vimentin和fibronectin,下调上皮细胞表型E-cadherin,同时上调EMT调控因子β-catenin;TGF-β1能诱导胃癌细胞系发生EMT现象,诱导7天后,细胞形态发生明显变化,免疫荧光和实时定量RT-PCR结果显示细胞E-cadherin表达量减少,vimentin和fibronectin表达量增加,证实EMT模型诱导成功;EMT模型组细胞Trop2表达明显增加,同时上调EMT调控因子β-catenin;免疫共沉淀实验推测Trop2和β-catenin可在胞内发生结合;Western-blot实验结果显示Trop2能通过上调β-catenin促进胃癌细胞发生EMT现象;激光共聚焦显微镜进一步观察到Trop2能通过促进β-catenin核内聚集,上调EMT表面标志物vimentin的表达。提示Trop2能通过上调β-catenin促进vimentin表达,进而诱导胃癌EMT和侵袭转移的分子机制。5.在体内转移模型中,敲减Trop2的胃癌细胞经裸鼠尾静脉注射后,肺部转移瘤形成数量少于空载对照组;肺部转移瘤组织的免疫组化结果显示,Trop2敲减组的Trop2、vimentin和Ki67的表达量明显少于空载对照组。研究结论1.Trop2在胃癌组织高表达,其高表达与胃癌分化、TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移和幽门螺旋杆菌感染有关,并预示着胃癌病人的预后不良,提示TroP2可作为治疗胃癌的分子靶点。2.Trop2高表达可促进胃癌细胞的增殖,抑制凋亡,促进胃癌细胞的迁移、侵袭能力,以及细胞的有丝分裂能力。3.Trop2和vimentin在胃癌组织上共同高表达,并呈正相关;胃癌组织中Trop2+/vimentin+表达和分化、TNM分期、远处转移等相关,Trop2+/vimentin+预示着胃癌病人的预后不良,提示胃癌中TroP2的表达可能和胃癌EMT现象有关。4.Trop2能通过调控β-catenin促进vimentin表达,从而诱导胃癌EMT现象和胃癌侵袭转移。