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小GTP酶是一类单体的G蛋白,通过在活性态和非活性态之间的转换,参与细胞信号的调控。GTP酶激活蛋白(GTPase–activatingproteins,GAPs)和GTP酶鸟苷酸交换因子(Guanine-nucleotideexchangefactors,GEFs)共同参与调节这一转换,前者促进小GTP酶水解,后者帮助小GTP酶结合GTP。 hArap3是具有ArfGAP和RhoGAP的双GAP活性的激活蛋白。hArap3有9个结构域,包含1个SAM、5个PH、1个ArfGAP、1个RhoGAP和ANK重复结构域。它在细胞扁平伪足的形成,细胞的迁移,细胞骨架的重组和细胞质膜的运输过程中发挥着重要的作用。根据前期的研究成果:边界为329-641氨基酸残基的Tev-PH-ArfGAP结构域在大肠杆菌中高效表达,但无法得到适合核磁三共振实验的蛋白质样品。通过优化表达载体获得Thrombin-PH-ArfGAP融合蛋白,其酶切效率相较于前期Tev-PH-ArfGAP的10h酶切40％提高到4h酶切100%,且无需二次Ni-NTA柱纯化。PH-ArfGAP对于温度较为敏感,这些改善减少了核磁样品的纯化流程和时间,有利于提高其在收集核磁数据时的稳定性。随后的1H,15NHSQC实验表明重组表达的目的蛋白具有一定的二级结构。通过PH-ArfGAP和Arf6的核磁滴定实验结果显示在PH-ArfGAP的1H,15NHSQC谱图中,有部分交叉峰消失或移动,二者是否有相互作用还在进一步探索中。运用核磁三共振技术收集了有效的数据,PH-ArfGAP的主链化学位移认证工作已经完成。 作为Arf6的GEF,hEFA6A蛋白对Arf6有高度的选择性和亲和性。它参与调节细胞内膜的循环,引起肌动蛋白细胞骨架的重组,调控树突棘的发育和巩固。hEFA6A全长1024个氨基酸,包括1个PH,1个Sec7,2个富含脯氨酸区域和一个无规则卷曲的区域,Sec7结构域起核心的GEF催化作用,PH结构域起定位于质膜的作用。本研究在大肠杆菌中原核表达Sec7(497-719)结构域,初次表达纯化,发现目的蛋白降解严重。通过分析Uniprot,Jpred,NCBI,Expript的比对和预测结果,选择7种不同边界的残基:Sec7(481-719)、Sec7(467-719)、Sec7(497-726)、Sec7(467-734)、Sec7(530-719)、Sec7(519-719)、Sec7(506-719)来探索结构域的稳定性。经过Ni-NTA柱和Superdex200柱纯化,SDS-PAGE电泳检测结果表明:Sec7(530-719)在室温下18d天后无明显的降解。随后的1H,15NHSQC实验表明重组表达的Sec7(530-719)具有一定的二级结构且溶液状态良好,为其后续的研究奠定了基础。 越来越多的研究表明许多致病菌的病原性与生物体内莽草酸途径中分支酸变位酶(Chorismatemutase,CM)的存在有着密切的关系,因此CM成为了开发新型抗生素和抗菌药物的热门靶标酶。采用分子克隆的方法,在感受态细胞BL21-Gold(DE3)中重组表达E.coliT蛋白的CM(CMT)。通过Ni-NTA亲和层析柱、Superdex75凝胶过滤层析柱和MonoQ阳离子交换层析柱纯化后得到电泳纯的重组蛋白,质谱鉴定结果与原始序列基本吻合。经过蛋白质晶体试剂盒的初步筛选,30天后在30%PEG4000,100mMNaAcpH4.6,200mMNH4Ac条件中发现CMT晶体,但晶体无衍射能力,且通过传统的“网络法”优化无法得到高衍射能力的晶体。利用核磁共振技术,分析CMT的1H,15NHSQC谱图信息,发现当蛋白浓度在4mg/mL以下时蛋白均一性良好,但浓度上升到8mg/mL以上时蛋白出现严重的聚合;同时发现低浓度的Chaps对CMT的聚合有明显的改善。结合以上信息,指导设计CMT晶体的优化方案,获得了高衍射能力的CMT晶体,为CMT结构的解析奠定了坚实的基础。