糖皮质激素(glucocorticoids, GCs)是由肾上腺皮质束状带细胞分泌的一种类固醇(甾体)激素。其生理功能包括对糖、蛋白质和脂肪代谢的调节、对循环系统功能的调节、对免疫系统功能的调节等。在机体遇到强烈应激刺激时,糖皮质激素分泌迅速增多,增强机体对有害刺激的抵抗力,维持器官、组织的正常功能活动。因此,糖皮质激素被称为应激反应的枢纽。除生理功能外,糖皮质激素还在临床上广泛应用,发挥抗炎、抗休克、抗过敏及免疫抑制等药理作用。糖皮质激素的药用剂量远远超过其生理剂量,二者产生的效应也不完全一致,作用机制更是多种多样,从而引起人们对糖皮质激素作用机制的深入探索。20世纪80年代,“神经-内分泌-免疫网络”概念的提出,使得糖皮质激素对免疫系统功能的调节,成为人们普遍关心的研究课题之一。一方面,作为临床上广泛应用的抗炎药物和免疫抑制剂,糖皮质激素在药理剂量下对多项免疫功能起着明显的抑制作用;另一方面,作为应激反应的枢纽,糖皮质激素在生理剂量或应激后大量分泌的“应激剂量”下,对免疫功能则可能起着广泛而复杂的网络调节作用,以确保应激时各系统之间的功能协调统一和精细地执行。目前,国内外对糖皮质激素对免疫系统作用机制的研究,多为高剂量、长时间的作用,而在低剂量、短时间情况下作用如何,是否可能起促进或维持免疫系统功能的作用及其机制,尚无十分明确的结论。巨噬细胞是机体免疫系统的重要组成部分,在非特异性免疫防御及特异性免疫应答中均起十分关键的作用。静息状态的巨噬细胞被激活后,经过一系列信号转导途径,产生呼吸爆发,生成大量氧自由基,有效地发挥其杀伤病原体或肿瘤细胞的细胞毒作用。本课题选择巨噬细胞为研究对象,旨在探讨糖皮质激素在不同浓度、不同作用时间下对巨噬细胞呼吸爆发的影响及其机制。长期以来被广泛接受的糖皮质激素作用机制称为基因组机制,即糖皮质激素与胞内(核)受体结合,最终影响蛋白质的合成,从而实现其功能。其特点是应答时间较长,通常在三十分钟以上,甚至长达数小时、数日。但近年来的研究发现,糖皮质激素还存在不依赖基因组途径的其它作用,称之为非基因组作用,其特点为:作用快、恢复快;偶联大分子的糖皮质激素仍然发挥作用;不能被基因转录/蛋白合成抑制剂所阻断;不能被糖皮质激素核受体拮抗剂RU486所阻断。上述非基因组作用包括:特异性作用机制,即通过受体介导,及非特异性作用机制,即通过与细胞膜蛋白或脂质非特异性结合,改变细胞膜的理化特性(如流动性)或某些膜蛋白的微环境以发挥效应。糖皮质激素长期应用,易引起严重并发症,包括早期的血糖增高、低血钾、低血钙、高血压,后期的肾上腺皮质功能紊乱,严重继发感染,骨坏死等等。对糖皮质激素非基因组作用机制的阐述,可以指导我们合成亲水性的糖皮质激素衍生物,使其不进入胞内与经典的糖皮质激素受体结合从而减小通过传统基因组机制引起的副作用,而仍然可以通过非基因组机制起效发挥临床效应。由此,本课题进行了以下研究:1.糖皮质激素对巨噬细胞呼吸爆发的影响:皮质酮、硫酸皮质酮等在不同剂量、不同时间对PMA刺激巨噬细胞产生超氧阴离子的影响。2.皮质酮对巨噬细胞呼吸爆发影响的作用机制:应用RU486、CHX及BSA偶联的皮质酮阻断基因组机制,应用荧光偏振法检测巨噬细胞胞膜流动性,应用Western Blotting方法检测PMA刺激巨噬细胞时PKC磷酸化的水平,探讨皮质酮对巨噬细胞呼吸爆发影响的可能机制。3.糖皮质激素衍生物的合成、鉴定及作用研究:以氢化可的松为原料,以赖氨酸、苯丙氨酸为载体,与氢化可的松的21位羟基偶联,合成糖皮质激素衍生物——氢化可的松-21-赖氨酸酯盐酸盐(HL)、氢化可的松-21-苯丙氨酸酯盐酸盐(HP),并采用核磁共振氢谱和质谱对糖皮质激素衍生物进行结构鉴定。研究糖皮质激素衍生物对PMA刺激巨噬细胞产生超氧阴离子的影响。主要研究结果如下:1.皮质酮、硫酸皮质酮均能在30分钟内快速增加PMA刺激的巨噬细胞超氧阴离子产生量。2. RU486、CHX及BSA偶联的皮质酮不能阻断皮质酮的快速作用,皮质酮对巨噬细胞胞膜流动性无显著影响,能快速抑制PMA刺激的巨噬细胞PKC磷酸化水平。3.合成了氢化可的松-21-赖氨酸酯盐酸盐和氢化可的松-21-苯丙氨酸酯盐酸盐,采用核磁共振氢谱和质谱方法鉴定,结果表明合成的糖皮质激素衍生物结构正确。新型糖皮质激素能在30分钟内快速增加PMA刺激的巨噬细胞超氧阴离子产生量。以往一般认为,糖皮质激素抑制免疫,而本项目发现糖皮质激素能够快速促进巨噬细胞呼吸爆发,由此推测在急性应激状态下,体内糖皮质激素分泌迅速增加,在短时间内有可能增强机体免疫功能,而不是以往认为的单纯地抑制免疫。由于本实验中糖皮质激素在30分钟内起效,而且新合成的亲水性的糖皮质激素衍生物也有同样效应,同时阻断经典基因组机制仍起作用,我们推测糖皮质激素是通过非基因组机制发挥作用。此外,本项目中糖皮质激素衍生物的合成为糖皮质激素的临床应用和新产品开发提供了新的策略,有助于寻找新的激素替代品,减少副作用,从而将糖皮质激素快速非基因组机制研究从基础理论研究扩展到了应用领域。