灿烂弧菌（Vibrio splendidus）是海水养殖动物的主要致病菌,由该菌引起的刺参“腐皮综合症”具有传染面积大和死亡率高等特点。Ⅲ型分泌系统（T3SS）分泌病原菌重要的毒力因子,这些毒力因子通过T3SS的针状复合物直接输送至宿主细胞内,进而干扰细胞功能和裂解细胞导致宿主发病。然而,迄今为止尚未见有关灿烂弧菌分泌系统及其效应因子功能的研究。本研究针对灿烂弧菌T3SS的ATPase及其效应因子的鉴定与功能进行研究,获得结果如下:（1）灿烂弧菌T3SS的ATPase重组蛋白Vscn具有ATP酶活性:克隆vscn基因,构建表达载体p ET-28a-vscn,转入BL（DE3）感受态中表达并获得重组蛋白,结果表明重组的Vscn具有明显的ATP酶活性。为了检测Vscn与致病性的相关关系,构建了灿烂弧菌vscn的基因敲除菌株△vscn,vscn基因的缺失对灿烂弧菌生长无影响,灿烂弧菌浸泡感染刺参两周后的实验结果表明△vscn的LD50为1.8×101 0 CFU/ml,相比于野生型菌株V.splendidus的2.5×107 CFU/ml,降低了3个数量级（P<0.05）,表明Vscn在灿烂弧菌致病过程中发挥重要作用。（2）灿烂弧菌T3SS效应因子Hop的鉴定:刺参体腔液分别刺激野生型和△vscn,实时荧光Real-time PCR检测结果表明,△vscn中的hop基因几乎不表达,表明Hop可能是T3SS的效应因子。分别将DTAF荧光染料标记的野生型菌株和△vscn与刺参原代细胞共孵育3 h后,共聚焦显微镜表征结果表明,灿烂弧菌可聚集于刺参细胞表面,且△vscn的细胞聚集能力较野生型菌株降低。通过构建p GEX4t-2-hop表达载体,获得重组蛋白,并制备Hop的多克隆抗体,结合荧光原位杂交FISH实验证明野生型菌株中Hop能够分泌到刺参体腔细胞中,而△vscn菌株感染后刺参细胞中无荧光信号,表明Hop是灿烂弧菌T3SS的效应因子。（3）灿烂弧菌T3SS效应因子Hop的功能研究:我们从细胞毒性、调控宿主免疫基因表达和其自身表达三个方面对Hop进行了研究。Hop对刺参细胞有毒性作用,当分别添加30,50,60,80和100μl的蛋白时,刺参体腔细胞的存活率分别下降至42%,26%,32%,30%和20%。注射有活性Hop蛋白组的刺参C1q和caspase的表达水平比注射热变性蛋白组的基因表达上调了1.83倍和2.95倍。hop基因的表达亦受宿主免疫因子和自身菌体密度的调控,刺参体腔液刺激可导致hop基因表达上调4.5倍;全菌ELISA实验表明,菌体只有到达对数生长后期(OD600=1.0)时,能够分泌大量Hop蛋白,表明Hop蛋白的分泌具有菌体密度依赖性。本研究表明,灿烂弧菌vscn基因编码灿烂弧菌T3SS的ATPase,介导灿烂弧菌的致病力。Hop为灿烂弧菌T3SS的效应因子可直接进入刺参体腔细胞,且Hop具有宿主细胞毒性和免疫基因表达激活等功能。然而,vscn基因的缺失导致Hop不能直接从灿烂弧菌注射至刺参体腔细胞中。vscn基因敲除菌株的构建为后续筛选并鉴定灿烂弧菌T3SS其它效应因子奠定了坚实的基础,并且为抑制灿烂弧菌的致病力提供新的靶位点,为发展新颖的灿烂弧菌抑制剂提供参考。