目的和意义大肠癌是世界上第三大肿瘤,也是导致肿瘤性死亡的第三大原因,其年新发病例大约为一百万,年死亡人数超过五十万。近年来,由于我国人民生活方式、饮食结构、环境因素等的改变,大肠癌的发病率及死亡率呈逐年上升趋势。因而对大肠癌发生发展机理的进一步研究十分必要,miRNAs的出现让人们看到了大肠癌的诊断和治疗的新曙光。microRNAs(miRNAs)是一种21～25nt长的单链RNA,在进化上具有高度的保守性,在动物中,它通过与靶标mRNA不完全互补配对抑制蛋白翻译,调节内源基因表达,且在基因表达调控中扮演重要角色。动物中miRNA与靶标mRNA不完全配对结合,同一miRNA可调控不同nRNA而不影响其完整性；因而一种miRNA改变,可影响多种蛋白翻译和信号通道。人类相关miRNA至今为止共发现1000多种,通过与不同靶标mRNA结合,可调控大约30%的人类基因。由于niRNAs可调控细胞生长、增殖、分化、凋亡等过程,Calin et al于2002年首次发表文章,将niRNAs与癌症联系起来。他们发现：miR-15和miR-16位于13号染色体上的抑癌基因位置,二者基因及表达的减少或缺失存在于大多数(大约为68%)慢性淋巴细胞白血病患者中,即二者与慢性淋巴细胞白血病有关。随后,microRNAs与肿瘤关系的进一步研究,大量研究证实microRNAs可能作为一种新的方法,应用于肿瘤的筛查、诊断、预后和化疗反应预测等各个方面。miRNAs的发现及其深入研究,为我们了解复杂的基因网络调控机制开辟了新的领域,也为癌症的早期筛查、诊断、治疗等方面提供新的理论基础及方法。2003年Michael等人首先发现了大肠癌中新的niRNAs:miR-143和miR-145,现在大肠癌中研究较多的有100多种miRNAs,其与靶标相互作用,调节信号通道相关蛋白表达,与大肠癌的发生发展及诊治等密切相关。大肠癌中nicroRNAs研究以单个microRNA研究较多,系统研究较少。因而本研究以芯片结果的系统研究为基础进一步研究肠癌相关nicroRNAs的生物学功能调控。在前期研究中,我们通过对4对配对的肠癌和正常组织进行microarray分析,发现与正常组织相比,癌症组织中表达差异(3倍以上)的miRNAs共64种。其中癌症组织中表达高的有30种,倍数较高的有：hsa-miR-16、hsa-miR-106a、hsa-miR-20a等;表达低的有34种,倍数较高的有：mmu-miR-1224、hsa-miR-1298、hsa-miR-1275等。虽然有大肠癌组织中hsa-miR-16和hsa-miR-106滚达的相关研究,但缺乏相关大肠癌生物学功能调控研究,且相关临床病理学分析也较少,因而我们选定癌症组织表达高的miR-16(10倍), miR-106a(4倍)进行大肠癌冰冻组织的RT-PCR验证、相关临床分析及功能探索。在本研究中,我们参考前期关于大肠癌的niRNA表达谱研究,利用定量realtime PCR技术检测52对大肠癌组织相对于癌旁正常组织的hsa-miR-16和hsa-miR-106a表达,分析它们与分期、淋巴结转移及分化等临床特征关系；探索其在大肠癌生物学功能调控中的作用；并进一步分析miR-16促进凋亡的相关分子机制,以期将来为大肠癌的分子靶向治疗提供理论基础和新的思路。主要方法和结果一、miR-16和niR-106a在肠癌组织中表达及其临床病理关系1.miR16在多数大肠癌组织中低表达,与组织分化有关。收集52例大肠癌患者肿瘤及周围非肿瘤组织手术标本,提取RNA,反转录后得到cDNA模板,运用TaqMan MGB(minor groove binder)探针法检测肿瘤组织中miR-16相对于癌旁正常组织的表达量,分析其表达与临床病理资料之间的关系。如果相对表达量小于1,则认为低表达。反之,则认为高表达。结果表明,miR-16在多数组织中低表达,其中67%(35/52)的大肠癌组织中miR-16(Z=-2.025,P=0.043)低表达。miR-16表达与组织分化相关(T=3.323,P=0.008),肿瘤组织分化程度越低,miR-16表达越低。MiR-16与性别、年龄、TNM分期和淋巴结转移无相关性(P>0.05)。2.miR-106a在肠癌组织中高表达,与TNM分期及淋巴结转移有关。运用TaqMan MGB(minor groove binder)探针法检测肿瘤组织中miR-106a相对于周围非肿瘤组织的表达量,然后分析二者与临床病理资料之间的相关性。结果表明,miR-106a在肿瘤组织中高表达。在52例大肠癌组织中,73%(38/52)大肠癌组织]miR-106a (Z=-3.748,P=0.000)高表达,miR-106a在大肠癌组织中相对于周围非瘤组织表达的均数为3.1。miR-106a的高表达与TNM分期(T=2.813,P=0.003)有关,TNM分期越高,1niR-106a表达越高。miR-106a的高表达也与淋巴结转移有关(T=-2.635,P=0.008)相关,miR-106a在有无淋巴结转移肿瘤组织中均数为1.29vs4.94。与无淋巴结转移肿瘤组织相比,有淋巴结转移的肿瘤组织miR-106a表达较高。miR-106a的表达与性别、年龄、组织分化无关(P>0.05)。二、miR-16和niR-106a;对肠癌细胞增殖和凋亡的影响1.miR-16对肠癌细胞增殖和凋亡影响1.1miRl6抑制HCT116和LOVO细胞增殖,对SW480和SW620细胞增殖无抑制作用HCT116和LOVO细胞均为p53野生型细胞,SW480和SW620细胞均为p53突变型细胞。因细胞增殖和凋亡与p53状态密切相关,固选上述四种细胞系作为研究对象。采用瞬时转染HCT116、LOVO、SW480和SW620细胞,分别分为三组：inhibitors组,阴性对照组,miR-16mimics组。细胞转染72小时CCK8试剂盒分别检测各组细胞吸光值。结果为：miR-16过表达可抑制HCT116和LOVO细胞增殖,差别有显著性(F值分别为53.611和78.086,P值均为0.000)； MiR-16对SW480和SW620增殖影响尚无统计学意义(P>0.05),因而miR-16的增值抑制作用可能与p53状态相关。MiR-16inhibiitors对细胞增值影响无统计学意义,可能是miR-16对细胞增值影响有阈值范围,低于相应的阈值可能导致影响较小而无统计学意义。1.2miR16通过抑制Cyclin D1和CDK6表达而诱导HCT116和LOVO细胞G0/G1期阻滞采用瞬时转染HCT116和LOVO细胞,分别分为三组：inhibitors组,阴性对照组,miR-16mimics组。细胞转染72小时,PI试剂盒检测细胞周期,蛋白免疫印记检钡Cyclin D1和CDK6表达。结果为：miR-16可使HCT116和LOVO细胞阻滞于G0/G1期,差别有显著性(F=37.025,P=0.000和F=17.478,P=0.003)。 miR-16可抑制Cyclin D1和CDK6表达。结果提示miR-16可能通过Cyclin D1和CDK6途径诱导HCT116和LOVO细胞G0/G1期阻滞,从而抑制细胞增殖。1.3miR-16诱导HCTl16和LOVO细胞凋亡,对SW480和SW620细胞无凋亡诱导作用采用瞬时转染HCT116、LOVO、SW480和SW620细胞,分别分为三组：inhibitors组,阴性对照组,miR-16mimics组。细胞转染72小时,AnnexinV和7-AAD凋亡试剂盒检测细胞凋亡。结果为：miR-16可诱导HCT116和LOVO细胞凋亡,差别有显著性(F值分别为85.387和53.493,P值均为0.000)。miR-16对SW480和SW620细胞凋亡影响尚无统计学意义(P>0.05)。结果提示miR-16也可促进HCT116和LOVO细胞凋亡；同样,miR-16诱导细胞凋亡作用也可能与细胞的p53状态相关。2.miR-106a;对肠癌细胞增殖和凋亡的影响2.1miR-106a抑制HCT116细胞增殖采用瞬时转染HCT116细胞,分别分为三组：空白对照组,阴性对照组,miR-106a mimics组。细胞转染72小时CCK8检测各组细胞吸光值。结果为：miR-106a可抑制HCT116细胞增殖,差别有显著性(F=114.484,P=0.000)。2.2miR-106a诱导HCT116细胞凋亡采用瞬时转染HCT116细胞,分别分为三组：空白对照组,阴性对照组,miR-16mimics组。细胞转染72小时,Annexin V-PE和7-AAD凋亡试剂盒检测细胞凋亡。结果为：miR-106a可诱导HCT116细胞凋亡,差别有显著性(F=30.963,P<0.01)。结果表明miR-106a可促进细胞凋亡。三、miR-16诱导凋亡机制探讨1.miR-16通过抑制survivin表达促进HCT116和LOVO细胞凋亡。采用瞬时转染HCT116和LOVO细胞,分别分为三组：inhibitors组,阴性对照组,miR-16mimics组。细胞转染72小时,提取蛋白,蛋白免疫印记检测survivin、 Caspase9、Capase8和Caspase3表达。结果为：miR-16可明显抑制Survivin蛋白表达,促进活化的Caspase9和Caspase3表达,而Capase8表达无变化。结果提示miR-16是通过线粒体途径发挥作用,从而进一步证明了其凋亡诱导作用。2.survivin是miR-16的靶标之一。采用瞬时转染HCT116和LOVO细胞,分别分为三组：inhibitors组,阴性对照组, miR-16mimics组。RNA于细胞转染48小时后提取,并逆转为cDNA,定量real time PCR检测survivin mRNA表达。结果为：miR-16可抑制HCT116和LOVO细胞survivin mRNA表达,差别有显著性(F=15.607,P=0.017和F=14.891,P=0.018)。miR-16对survivin蛋白表达水平影响如上一结果所述。HCT116细胞采用荧光素酶报告系统验证miR-16与survivin结合并抑制其表达。分为四组：阴性对照+野生型survivin3’UTR组,阴性对照+突变型survivin3’UTR组,miR-16+野生型survivin3’UTR组,miR-16+突变型survivin3’UTR组。HCTl16细胞双转染48小时后检测各组荧光素酶表达。结果为：各处理组荧光素酶活性差异有显著性(F=67.952,P=0.000)。进一步组间比较提示：与阴性对照组相比,1niR-16mimics可抑制含野生型Survivin3’UTR组荧光素酶活性,但未能影响突变型survivin3’UTR荧光素酶活性。结果提示miR-16可从mRNA水平和蛋白水平抑制survivin表达,且miR-16是直接抑制survivin表达,说明survivin是miR-16的靶基因之一。3.p53通过miR-16调节survivin表达采用瞬时转染HCTl16和LOVO细胞,分为两组：阴性对照,p53siRNA组。转染后48小时提取RNA,逆转为cDNA并定量real time PCR检测miR-16表达水平；转染72小时后提取蛋白,蛋白免疫印记检钡survivin、cycliD1和CDK6表达。结果为：p53siRNA可敲低细胞中p53的表达,p53敲低后,miR-16表达降低,差异有显著性(t=17.421,P=0.000和t==7.142,P=0.019)。p53敲低,miR-16表达降低的同时,可见miR-16靶基因survivin增高,伴有cyclinD1和CDK6表达增加。结果提示p53可通过miR-16调节其诱导凋亡的下游分子抑制survivin表达,进一步证实了miR-16的凋亡诱导作用。结论综合以上研究结果,我们可以得出以下结论：1.miR-16在大肠癌中低表达,与组织分化相关；2.miR-106a在大肠癌中高表达,与TNM分期和淋巴结转移有关；3.miR-16可抑制肠癌细胞增殖,促进肠癌细胞凋亡,其对细胞增殖和凋亡影响与p53状态有关；4.miR-106a可抑制肠癌细胞增殖,促进肠癌细胞凋亡；5.miR-16通过survivin/内源性途径诱导HCT116和LOVO细胞凋亡；6.miR-16可从AmRNA和蛋白水平抑制survivin表达,survivin是miR-16靶标之一：7.p53通过miR-16调节survivin表达