病原菌环境适应性和致病性的分子机制研究是动物病原菌研究的重要内容,其中严谨反应(stringentresponse,SR)是细菌环境适应性反应的重要机制之一,(p)ppGpp是介导SR重要的信号分子。本实验室的前期研究发现,猪链球菌(Streptococcussuis)基因组编码两个(p)ppGpp合成酶,RelA同时具有(p)ppGpp合成酶和(p)ppGpp水解酶结构域,而RelQ仅具有(p)ppGpp合成酶结构域;RelA在氨基酸饥饿和葡萄糖饥饿诱发的SR中具有重要作用,但葡萄糖饥饿诱发细菌SR的机制尚不清楚。本论文对(p)ppGpp及其合成酶调控猪链球菌的严谨反应和致病性的分子机制进行了研究,取得的主要研究结果如下:1.葡萄糖饥饿诱发猪链球菌严谨反应的分子机制研究本实验室前期研究发现,与大肠杆菌不同,猪链球菌的RelA并不是通过与乙酰载体蛋白(ACP)相互作用来调控碳源饥饿诱发的严谨反应。本研究通过细菌双杂交、Pull-Down和ELISA实验发现,HPr丝氨酸激酶(HPrK)能够与RelA相互作用,其相互作用主要发生在它们的N-端结构域(RelA_N和HPrK_N)。同位素标记实验发现,RelA的(p)ppGpp合成结构域位于其N-端(RelA_N),而HPrK的激酶结构域位于其C-端(HPrK_C);RelA_N端与HPrK互作能够促进后者的激酶活性,而HPrK与RelA互作能够抑制后者的(p)ppGpp合成酶活性,relA基因缺失菌株中HPrK的底物(HPr)磷酸化水平降低。这些结果提示,在猪链球菌中,RelA可能通过与HPrK相互作用,促进HPr的丝氨酸位点磷酸化,进一步激活碳代谢物阻遏/激活系统(CCR/CCA)来调控碳源代谢。2.(p)ppGpp合成酶调控猪链球菌生长和致病性的研究由(p)ppGpp调控的严谨反应与很多致病菌的行为密切相关,缺失了(p)ppGpp合成酶可以导致多种多样的表型变化,但在不同细菌中的表型变化不同。为了研究(p)ppGpp合成酶或(p)ppGpp对猪链球菌致病性的影响,本研究利用亲本菌SC-19和双基因缺失菌株△relA△relQ为材料,比较了它们在生长和致病力上的差异。结果发现,基因缺失菌株生长变慢,链变长,对HEp-2细胞的粘附和侵入能力减弱,抗血液清除和吞噬能力下降;基因缺失菌株对小鼠的致病性显著降低,更容易被机体清除。荧光定量RT-PCR结果显示,链长相关基因cps2A、gpsB和毒力相关基因gapdH、fbps、arcA、vicR、virD4、sod、epf均下调表达。这些结果说明(p)ppGpp合成酶或(p)ppGpp可以通过调控猪链球菌的生存能力和毒力因子的表达来影响其致病性。3.(p)ppGpp合成酶与CodY协同调控猪链球菌生长和致病性的研究对某些细菌的研究发现,转录因子CodY与(p)ppGpp合成酶可以协同调控病原菌的严谨反应和致病性。在单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等细菌中均发现,缺失CodY可以回补(p)ppGpp合成酶缺失菌株的一些表型。为了研究猪链球菌中(p)ppGpp合成酶与CodY的协同调控作用,本研究在△relAA△relQ菌株基础上构建了△relAA△relQ△codY三基因缺失株,比较研究了SC-19、△relA△relQ、△codY和ArelA△relQ△codY的生长和致病性等特征,结果发现,△relA△relQ△codY的荚膜厚度和链的长短出现回补,而在致病力方面,codY的缺失并没有使△relA△relQ的毒力出现回补现象。EMSA实验发现,CodY可以直接与relA基因启动子互作,说明在猪链球菌中,CodY可能通过调控RelA的表达来实现对细菌毒力和严谨反应的间接调控作用。这可能是CodY调控细菌毒力和严谨反应的一种新机制。