γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid,γ-PGA)是由谷氨酸单体聚合而成的阴离子型多聚物,具有可食性、吸水性、保水性、生物可降解性、可螯合金属离子、无毒和环境友好等特性,广泛用于医药、食品、农业、环境保护和护肤品等领域。目前,γ-PGA研究主要存在的问题有检测效率低下或准确度不高,菌株生产效率不高等。这在一定程度上增加了γ-PGA的生产成本,限制了γ-PGA进一步开发应用。为此,本文旨在建立一种检测准确、步骤简单的γ-PGA含量检测方法,并通过ARTP诱变选育出一株高产γ-PGA的菌株,以达到提高γ-PGA的产量并降低生产成本的目的。另外,基于前期发现纳豆激酶(NK)等蛋白副产物对γ-PGA生产可能存在抑制的预研结果,本文进行了合成融合片段的研究,为基于基因敲除构建NK缺陷菌,进而为提高γ-PGA的产量奠定基础。主要研究内容如下:(1)基于Cu2+络合原理,建立了一种γ-PGA的高效检测方法。测定条件优化,结果显示在Cu2+浓度3mg/mL,反应时间30min,反应温度15℃,反应pH7.5的条件下,检测效果最佳,其平均回收率为95.82%,平均相对偏差为0.18。红外光谱分析表明Cu2+与γ-PGA的羧基氧发生了配位。对紫外分光光度法、称重法与Cu2+络合检测法比较分析发现,精确度及回收率从高到低依次为Cu2+络合检测法、紫外分光光度法和称重法,表明Cu2+络合检测法准确有效。(2)通过多种方法(固体平板、酪蛋白板、血纤维蛋白板、形态观察、16S rDNA序列分析、进化树分析及aprN基因筛选法),鉴定筛选菌株MA1为B.subtilis natto(Bacillus subtilis natto)。通过酪蛋白板圈径比、孔板和摇瓶发酵筛选,确定最佳平板检测时间为24 h,24微孔板与摇瓶筛选的相关性较好(R2约0.98),可代替摇瓶进行突变菌的发酵培养。经过5轮ARTP诱变选育出一株γ-PGA高产菌株B.subtilis natto mMA8,其γ-PGA产量达到9.22 g/L,较出发菌株提高了 22%,传代培养(5代)证明其遗传稳定性良好。经过对诱变菌圈径比和γ-PGA产量比较,发现圈径比与γ-PGA产量多数呈正比,样本量为24个,R2值为0.64,可认为两者之间存在线性关系。(3)aprN基因与敲除框的融合PCR研究。敲除框左臂、右臂和lox序列最佳PCR退火温度依次为66.7℃、66.7℃和56.9℃。方法一扩增融合片段,第一轮最佳退火温度为49℃,第二轮为58℃。方法二扩增融合片段,48.9℃作为左臂和lox序列、lox序列和右臂共同的退火温度,56.8℃作为敲除框片段的最佳退火温度。结果表明,方法二比方法一扩增融合片段效果好。本研究建立的新型Cu2+络合检测法为准确定量检测γ-PGA提供了工具,为后续γ-PGA高效生产菌株的筛选奠定了基础。筛选获得了一株较出发菌株高产的γ-PGA产生菌,有力促进了γ-PGA的高效生产。aprN基因及敲除框融合PCR的研究为敲除NK基因,解除其对γ-PGA生产的抑制奠定了基础。本研究对γ-PGA的生产具有重要的理论意义与参考价值。