【研究背景】食管癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是一种常见的人体消化道恶性肿瘤,很长一段时间,其发病率和死亡率都非常高,特别是在某些亚洲国家如中国和新加坡等非常普遍。随着癌症诊断技术和手术方法的提升使患者的生存率有了很大的提高,但多数食管癌恶性肿瘤患者在医院检查确诊时已处于癌症晚期,并且患者预后相对较差,治疗效果达不到预期疗效,目前仍然主要依靠一些切除手术方案进行治疗。因此,研究食管癌的基本发病机理及分子肿瘤发生机制,并寻找精准疗效,尽可能对正常细胞杀伤力及副作用小的天然药物,仍一直是各国专家研究人员迫切需要解决的问题。近年来,中药在肿瘤治疗中的潜能受到了广泛的关注,展现出了一定的临床优势,主要表现在能够有效地提高患者术后的抵抗力、对肿瘤复发的抑制和转移减少等方面。中药具有悠久的历史,目前中药治疗已经广泛用于治疗癌症。蟾毒灵是一种常见的从蟾酥中提取的中药,是一种天然小分子,分子式为C24H34O4,相对分子质量为386.5.蟾毒灵被发现具有多种药理特性,包括心脏保护、凋亡诱导和抗炎作用等,对肿瘤细胞亦具有明显的杀伤作用。近年来,许多学者研究了蟾毒灵的抗肿瘤作用及其作用机制方面,已经证实了蟾毒灵对多种肿瘤发挥着不同程度的重要作用。由研究人员在对胃癌细胞的研究结果发现蟾毒灵能够抑制胃癌细胞增殖,抑制胃癌细胞的侵袭与转移。有研究报道发现蟾毒灵可促使人骨肉瘤U-2OS细胞凋亡,增加细胞色素C、AIF和Endo G在细胞质中的蛋白水平,提示蟾毒灵通过内质网应激、caspase-和线粒体依赖途径诱导U-2OS细胞的凋亡。有文献报道,蟾毒灵也可促进前列腺癌细胞凋亡;还有研究发现蟾毒灵可通过影响相关通路中的信号分子从而发挥对肿瘤细胞的抑制作用。这些发现都为蟾毒灵在临床上的抗肿瘤应用提供了思路。然而,迄今为止蟾毒灵对食管癌增殖的影响及其分子机制的研究较少,尚未有明确的研究报道。因此本研究通过体内外实验模型初步观察蟾毒灵对食管癌细胞增殖的影响,并初步探索其可能的研究机制。【研究目的】本实验以食管癌细胞为研究对象,拟通过研究蟾毒灵对食管癌细胞增殖、ROS水平及线粒体功能的影响,初步探讨蟾毒灵诱导食管癌细胞凋亡的机制,致力于为蟾毒灵在临床应用一线中对食管癌的治疗提供参考和依据。【研究方法】1、利用MTT、LDH实验、显微镜下观察细胞状态监测不同浓度蟾毒灵对食管癌细胞生存的影响,使用克隆形成实验和EDU实验等检测细胞增殖活力的实验方法;通过荷瘤小鼠皮下成瘤实验检测蟾毒灵对肿瘤形成的影响。2、利用DAPI染色、TUNEL染色、Annexin-V/PI双染法凋亡检测实验探究蟾毒灵对食管癌细胞凋亡的影响,利用蛋白印迹实验及q PCR检测凋亡相关蛋白及m RNA的表达等。3、通过检测ROS含量、GSH和GSSG水平、线粒体膜电位检测、ATP生成等研究蟾毒灵对食管癌细胞ROS以及线粒体功能的影响。【研究结果】1、MTT、LDH实验结果表明蟾毒灵对KYSE-70细胞活力具有明显的抑制作用;克隆形成实验和Ed U结果表明蟾毒灵可显著抑制KYSE-70细胞增殖;裸鼠体外成瘤实验表明,蟾毒灵能够明显抑制食管癌的生长。2、DAPI染色结果显示,蟾毒灵处理后KYSE-70细胞的核出现浓缩、聚集、碎裂等凋亡形态;TUNEL染色和流式细胞检测结果显示,蟾毒灵作用后可促进KYSE-70细胞凋亡;q PCR和Western blot结果显示,蟾毒灵处理后KYSE-70细胞内凋亡相关分子Bax的表达上调,Bcl-2的表达下调,p65磷酸化水平显著减少,而p65的总体水平并无变化,结果提示:蟾毒灵能够促进食管癌细胞凋亡。3、蟾毒灵作用后,KYSE-70细胞的ROS水平显著升高,GSH水平随着药物浓度的增大而呈下降趋势,GSSG含量逐渐增加,线粒体膜电位呈现明显的下降趋势,ATP的生成量显著减少。【研究结论】1、蟾毒灵可以抑制食管癌细胞KYSE-70增殖;2、蟾毒灵可以促进食管癌细胞凋亡;3、蟾毒灵可以促使食管癌细胞KYSE-70内ROS的累积抑制线粒体功能。