研究背景胰腺癌是一种恶性程度极高、预后差的消化系统恶性肿瘤。胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)为最常见的病理类型。流行病学资料显示,胰腺癌位居我国肿瘤死亡原因第六位,发病率呈上升趋势。多数患者初诊时因肿瘤局部侵犯或远处转移失去手术机会。胰腺癌肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)以大量炎性细胞浸润和广泛纤维化为主要特点。针对胰腺癌TME探索胰腺癌进展机制是目前的研究热点。TME中肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)对胰腺癌发生发展和补体免疫逃逸具有促进作用。细胞外囊泡(extracellularvesicles,EV)参与TME中不同细胞间信号传递和物质交换,是胰腺癌TME中调控TAM分化和功能改变的关键介质。迁移体是近几年新发现的一类依赖细胞运动的EV样结构,其中富集众多信号介导因子、趋化因子和细胞因子等调控蛋白,对生物体发育、信号转导等具有重要意义。胰腺癌细胞产生的迁移体(pancreatic cancer cell-derived migrasome,PCCDM)对 TME 中免疫细胞尤其是TAM的表型及功能的影响,目前缺乏相关研究。研究目的明确PCCDM中调控胰腺癌TME的关键蛋白成分,分析PCCDM对TME中免疫细胞比例变化的影响以及该变化对胰腺癌生长的影响;探究PCCDM对TAM表型及功能的调控作用;探讨PCCDM诱导后的TAM对胰腺癌细胞功能的影响;探究PCCDM诱导后的TAM对T淋巴细胞的影响;探讨PCCDM诱导的TAM对胰腺癌补体免疫逃逸的影响;筛选PCCDM中富集的一些关键蛋白,初步探索PCCDM中对免疫微环境具有调控功能的重要蛋白成分在胰腺癌组织中的表达情况,探究其与患者临床病理特征以及组织中免疫细胞浸润的关系。研究方法1.通过差速离心和密度梯度离心的方法提纯人和小鼠PCCDM,利用电镜和共聚焦显微镜对PCCDM进行超微结构和形态学观察,通过蛋白质谱和蛋白芯片检测PCCDM中富集的细胞因子和趋化因子等调控蛋白,利用共聚焦显微镜观察关键蛋白富集情况。构建免疫健全小鼠胰腺癌腹腔种植瘤模型,通过注射PCCDM构建免疫微环境,探究PCCDM诱导的免疫微环境中免疫细胞比例变化以及该变化对胰腺癌生长的影响。2.利用小鼠巨噬细胞系RAW264.7和骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDMs)作为巨噬细胞模型,通过共培养的方法探究PCCDM对巨噬细胞形态及趋化能力的影响以及巨噬细胞吞噬PCCDM后表型及功能的变化;通过蛋白芯片和转录组测序对PCCDM诱导后巨噬细胞功能表型进行鉴定和分析。3.利用PCCDM诱导的巨噬细胞和对照组巨噬细胞的培养上清制作条件培养基,通过条件培养基刺激胰腺癌细胞,利用CCK8法检测条件培养基对胰腺癌增殖能力的影响,利用Traswell法检测条件培养基对胰腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响。4.通过ELISA检测经PCCDM诱导后巨噬细胞RAW264.7和BMDM培养上清以及小鼠腹腔灌洗液中影响肿瘤免疫关键蛋白的分泌情况;通过小鼠脾脏提纯CD4+和CD8+T淋巴细胞,利用巨噬细胞条件培养基的方法探究PCCDM诱导后巨噬细胞对T细胞增殖能力的影响,应用蛋白抑制剂探究巨噬细胞上清中该调控蛋白对T细胞增殖能力的影响。5.利用人巨噬细胞系THP-1作为巨噬细胞模型,通过胰腺癌条件培养基刺激的方法探究胰腺癌对THP-1表型的影响;利用人新鲜血清构建补体微环境,通过流式细胞术检测M2型巨噬细胞对胰腺癌补体免疫逃逸的影响;通过转录组学测序探究胰腺癌和PCCDM诱导的巨噬细胞基因表达差异以及对补体免疫逃逸的影响机制。6.筛选PCCDM中的对肿瘤免疫具有调控作用的关键蛋白,通过免疫组化染色和数据库的方法探究胰腺癌组织中该蛋白表达情况与患者临床病例特征及预后的关系以及与免疫细胞浸润的关系。研究结果1.胰腺癌细胞在迁移运动中大量产生迁移体,经鉴定发现PCCDM富含CXCL5、TGF-β1、integrin通路蛋白和Rab家族蛋白等多种调控免疫微环境的因子。经PCCDM诱导的小鼠腹腔免疫微环境中免疫细胞浸润增加,其中M2型巨噬细胞比例增加、T细胞比例明显减少,这种变化对小鼠胰腺癌生长具有促进作用。2.PCCDM可被巨噬细胞主动吞噬,并诱导巨噬细胞向PCCDM趋化。PCCDM诱导后的巨噬细胞中CD206+巨噬细胞比例增加,M2型巨噬细胞标记ARG1、IL-10和TGF-βl表达明显升高。蛋白芯片分析显示,在PCCDM诱导后的巨噬细胞中免疫抑制因子(TGF-β1,IL-4,IL-10,CSF1,CSF3,CTLA4和MMP9)以及对肿瘤具有重要作用的趋化因子和受体(CXCL5,CXCL9,CXCL12,CCL4,CCL7,CCL21,CCR3和CCR7)的表达水平较对照组巨噬细胞明显升高。转录组学测序结果显示,PCCDM诱导的巨噬细胞中表达上调的基因与促进肿瘤或免疫抑制相关的,包括IL-6、MMP9、MET、MYC、EGFR、CCL7、CSF3、CCL12、CXCL5、ITGA9、CDH5 和 CD274(即PD-L1);表达下调的基因中有众多调控免疫细胞增殖和活化的基因,包括CCL24、CX3CL1 和 MHC-II 类蛋白(H2-OA、H2-OB 和 H2-Q6)。3.在RAW264.7和BMDM巨噬细胞模型中,PCCDM诱导后的巨噬细胞对胰腺癌细胞增殖能力和侵袭迁移能力具有促进作用。4.PCCDM诱导后的RAW264.7和BMDM培养上清以及小鼠腹腔灌洗液中ARG1含量显著上升;PCCDM诱导后的巨噬细胞对T细胞增殖能力具有抑制作用,ARG1抑制剂可部分逆转该作用。5.胰腺癌诱导THP-1向M2型巨噬细胞分化,分化后的巨噬细胞通过分泌IL-6上调胰腺癌细胞CD59表达并促进胰腺癌发生补体免疫逃逸;PCCDM诱导后巨噬细胞分泌IL-6;PCCDM参与巨噬细胞对胰腺癌CD59表达和补体免疫的调控过程。6.PCCDM中富含CXCL5,胰腺癌组织和细胞系高表达CXCL5,胰腺癌组织中CXCL5高表达与患者T3分期、N2分期和病理低分化级别具有相关性;高表达CXCL5的患者预后相对较差;在CA242高的患者中CXCL5表达水平为独立危险因素;高表达CXCL5的胰腺癌组织中M2型巨噬细胞、中性粒细胞和IgG+浆细胞浸润增多。研究结论PCCDM中富含CXCL5和TGF-β1等调控蛋白,PCCDM可诱导抑制型免疫微环境促进肿瘤生长;PCCDM诱导的微环境中M2型巨噬细胞增多、T细胞减少;PCCDM可促进巨噬细胞趋化并诱导其转化为M2型巨噬细胞,促进胰腺癌增殖、侵袭和迁移,并通过分泌ARG1抑制T细胞增殖;PCCDM诱导的巨噬细胞通过分泌IL-6促进胰腺癌细胞高表达CD59,进而发生补体免疫逃逸;PCCDM中富含CXCL5,CXCL5高表达的胰腺癌患者预后差,组织中呈现抑制型免疫环境,表现为M2型巨噬细胞、中性粒细胞和lgG+浆细胞浸润增加。针对迁移体的治疗策略研究有可能为胰腺癌综合治疗提供新的思路。