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暗纹东方鲀是我国南方重要的淡水养殖种类之一。暗纹东方鲀精巢营养价值很高,规模化养殖全雄暗纹东方鲀,能够显著提高我国养殖暗纹东方鲀的经济效益。本研究采用转录组学、生物信息学和分子生物学的方法,初步探究了暗纹东方鲀性别相关基因在早期发育过程中的分子调控机制。主要研究结果如下:1.暗纹东方鲀幼鱼遗传性别的鉴定采用ARMS-PCR技术快速检测暗纹东方鲀的遗传性别。根据暗纹东方鲀amhr2激酶结构域内存在一个与性别连锁的错义突变SNP位点,设计特异等位基因引物,即在下游PCR引物3’末端不同碱基位点设计不同种类的错配碱基,进行特异性引物的筛选,并通过优化PCR反应体系与反应条件,建立暗纹东方鲀幼鱼遗传性别差异鉴定的ARMS-PCR方法。此外,为了判断ARMS-PCR方法鉴定暗纹东方鲀幼鱼遗传性别的可行性,我们同时利用直接测序法和组织切片法分别鉴定样品的遗传性别和表型性别。结果表明,利用ARMS-PCR方法可以快速区分暗纹东方鲀的遗传性别,并且ARMS-PCR方法的鉴定结果与直接测序结果相同,同时也与组织切片鉴定的表型性别一致。2.暗纹东方鲀早期发育阶段性腺组织的转录组分析对孵化后60~150日龄的暗纹东方鲀进行性腺差异的转录组测序和分析。结果显示,卵巢和精巢分别获得clean reads 54229278条和52089726条,其中分别有43588138和43837845条定位到参考基因组中,经过拼接组装后获得33247条unigenes,包含9890个新基因。差异表达基因分析结果显示,相邻发育时期卵巢中的差异表达基因数目普遍高于精巢,且性别间差异表达基因的数量远远高于性别内差异表达基因的个数。进一步对其显著性富集的Pathway进行筛选,共获得24条参与性别分化与性腺发育的代谢通路,其中神经活性配体-受体相互作用、MAPK信号通路和细胞周期等代谢通路中差异表达基因富集较多。从代谢通路差异表达的基因中筛选出cyp19a、cyp19b和hsd17b1等8个卵巢高表达基因以及dmrt1、cyp11a1和hsd3b等15个精巢高表达基因。上述候选基因为暗纹东方鲀性别决定和性别分化的分子调控机制的研究以及性别标记基因的开发提供重要的信息。3.暗纹东方鲀性别相关基因的克隆及结构分析根据转录组数据和已知河豚属鱼类的保守序列,分别设计了amhr2、cyp19a、dmrt1、sox9a和sox9b基因的简并引物,克隆了这5个基因的cDNA全长序列,分析了暗纹东方鲀性别相关基因的序列结构及相关生物信息学特征。暗纹东方鲀amhr2全长cDNA为1868bp(NCBI登录号:MH218814),编码513个氨基酸。cyp19a全长cDNA为1786bp(NCBI登录号:MH218815),编码514个氨基酸。dmrt1全长cDNA为1620bp(NCBI登录号:MH218816),编码294个氨基酸。Sox9a全长cDNA为1274bp(NCBI登录号:MH218818),编码227个氨基酸,Sox9b全长cDNA为1943bp(NCBI登录号:MH218819),编码489个氨基酸。基本理化性质结果显示,Amhr2、Dmrt1、Sox9a和Sox9b均属于不稳定的亲水性蛋白,仅Cyp19a属于稳定的亲水性蛋白。同源性和系统发育结果显示,Cyp19a和Dmrt1均与红鳍东方鲀和星点东方鲀同源性最高,亲缘关系最近;而Amhr2和两个Sox9均与红鳍东方鲀同源性最高,亲缘关系最近。4.暗纹东方鲀性别相关基因的表达研究对在暗纹东方鲀Ⅰ龄鱼不同组织和孵化后60~150日龄幼鱼性腺组织中amhr2、cyp19a、dmrt1、sox9a和sox9b的表达情况进行相对定量分析。组织表达结果显示,amhr2仅在性腺中表达,且卵巢中的表达量明显高于精巢;cyp19a主要在肌肉和卵巢中表达,其次在其他组织中也有少量表达;dmrt1主要在雄鱼中表达,且其表达模式具有精巢特异性;sox9a和sox9b均在雌鱼下丘脑中表达量最高,在脑、垂体、肝和眼等其他组织中也有较高水平的表达。早期发育阶段性腺组织的表达结果显示,在90日龄雄鱼精巢中sox9a和sox9b表达量均显著升高;在120日龄雌鱼卵巢中cyp19a表达量显著升高,而在120日龄雄鱼精巢中dmrt1表达量显著升高;在150日龄雌鱼卵巢和雄鱼精巢中amhr2表达量均显著升高。以上定量结果说明,这5个基因均参与暗纹东方鲀的性腺发育过程,其中cyp19a与卵巢发育相关,dmrt1与精巢发育相关,sox9a和sox9b与神经调控有关。