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心血管疾病逐年增高的发病率和死亡率对人类社会造成巨大负担,临床和实验证据表明,糖代谢异常、心脏血管内皮功能障碍、内质网应激和血管生成不足是心血管疾病的重要发病因素。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)在肝脏,脂肪组织,肌肉和胰腺等代谢相关组织中广泛表达,通过抑制胰岛素和瘦素的信号传导,破坏葡萄糖和脂质代谢稳态以及降低胰岛素敏感性,参与到多种细胞功能调节,近年来在心血管疾病中的作用日益受到人们的重视。本研究主要关注PTP1B在Ang II诱导的原代心肌微血管内皮细胞(CMECs)凋亡中的作用及机制,为阐明内皮细胞凋亡与RAAS之间的相互作用提供依据。目的:探讨内皮细胞凋亡和肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活之间的相互作用。方法:选取2周龄雄性SD大鼠,采用植块法分离培养原代CMECs,取第二代细胞,进行后续实验:1.筛选最佳干预浓度用于后续实验:根据Ang II浓度,将细胞分为Control、1nmol、2nmol、4nmol的四组,TUNEL和Caspase-3活性试剂盒检测不同AngII浓度PTP1B蛋白水平的变化,蛋白质免疫印迹(WB)实验检测凋亡相关蛋白的改变。2.研究AngII对CMECs的影响:将细胞分为实验分为Control组,Ang II组,TCS 401(8μM,PTP1B抑制剂)组,Ang II+TCS401组,共四组,蛋白质免疫印迹(WB)实验检测凋亡相关蛋白的改变。3.探讨PI3K通过调控PTP1B减轻AngII所致CMECs凋亡的机制:将细胞分为Control组,Ang II组,Ang II+TCS401组、Ang II+TCS401+LY294002四组。采用蛋白质免疫印迹(WB)检测细胞的凋亡情况。结果:1.Ang II诱导原代大鼠CMEC细胞的PTP1B表达增加:TUNEL和Caspase-3活性实验结果显示随着Ang II浓度的增加,PTP1B蛋白的表达升高,在4nmol时表达量最高(p<0.01)。因此我们选择AngII的浓度为4nmol用于后续研究。2.Ang II以浓度依赖性方式显著增加CMEC的凋亡:caspase-3活性检测、TUNEL及WB实验结果显示,与control组相比,AngII组的促细胞凋亡指标caspase-3活性显著增加(p<0.01)、抑制细胞凋亡的Bcl-2/Bax比值下降(p<0.05);3.抑制PTP1B减少Ang II诱导的CMECs细胞凋亡:TCS 401(8μM)用于抑制PTP1B表达。结果显示,与对照组相比,Ang II显著增加PTP1B蛋白表达,凋亡指数和caspase-3活性,而这些作用通过抑制PTP1B的表达而部分逆转。此外,Ang II降低抗凋亡因子Bcl-2/Bax比率,增加促凋亡因子cleaved caspase-3/caspase-3的比率,而TCS 401处理显著减弱这些效应。以上结果表明Ang II以PTP1B依赖性方式诱导CMEC的凋亡。4.Ang II上调PTP1B蛋白表达并抑制PI3K/Akt信号传导:为了探讨PTP1B在Ang II诱导的CMECs凋亡中的作用,我们使用WB检测了PTP1B的蛋白质表达变化,结果显示PTP1B蛋白表达在Ang II处理的CMEC中以剂量依赖性方式显著上调。此外,施加Ang II干预后,p-Akt和PI3K的蛋白质表达以剂量依赖性方式显著下调。5.PI3K/Akt途径被PTP1B抑制剂激活:Ang II干预后p-Akt和PI3K的表达下调,而PTP1B蛋白的表达增强。我们进一步探讨了PI3K/Akt通路是否参与了Ang II刺激后PTP1B介导的CMEC细胞凋亡。Western印迹结果显示,在Ang II处理的细胞中PI3K表达和Akt磷酸化水平降低,而通过与PTP1B抑制剂共同处理可以部分逆转这些作用。数据表明PI3K/Akt通路可能是Ang II后激活的PTP1B的下游信号,Ang II可通过调节PTP1B/PI3K/Akt通路诱导CMECs凋亡。6.LY294002部分降低PTP1B抑制剂的抗凋亡作用:为了进一步检测PTP1B和PI3K/Akt通路的关系,我们使用LY294002抑制剂抑制PI3K/Akt通路。结果显示,与Ang II+TCS 401组相比,进一步的LY294002处理显著降低了PI3K表达和Akt磷酸化;它还通过降低Bcl-2/Bax的比率和增加cleaved caspase-3/caspase-3的比率来促进CMECs细胞凋亡。结论:PI3K/Akt通路可能是Ang II诱导的活化PTP1B的下游信号,Ang II可通过调节PTP1B/PI3K/Akt通路诱导CMECs凋亡。