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本文首次利用抑制性差减杂交技术,成功建立戊糖代谢典型菌株休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)己糖和戊糖代谢的抑制性差减文库,主要结果如下:
分别以木糖和葡萄糖为碳源培养C.shehatae,采用TRIZOL方法提取总RNA,然后用mRNA纯化试剂盒方法,纯化出mRNA。用抑制性差减文库构建试剂盒构建出C.shehatae的抑制性差减文库,包括正库和反库。对文库的质量进行鉴定后,分别选取正、反两个文库中的部分差异性片段进行基因测序,其中正库测定了1000条EST,反库测定了500条EST。
用Phred/Phrap/Consed软件包对测得的差异EST分别拼接,用BLAST软件对Genebank Nt Database, Genebank Nr Database, SWISSPROT Database作序列相似性比对,用GO分类方法,对比对后的基因进行分类。用实时荧光定量分析方法对文库中部分差异基因进行分析,结果进一步表明,本研究所获得的两个文库的质量较好。
本研究成功得到了休哈塔假丝酵母在不同碳源培养下所表达出的部分差异基因信息和与木糖代谢流相关联的部分基因,在转录水平上对戊糖酵母糖代谢的功能基因进行了初步的研究,本研究成果可为木糖代谢微生物的分子代谢机制、转录水平调控和重组菌株的构建等相关研究提供了一个良好的技术平台,其生物信息的深入挖掘可为木糖发酵产乙醇的系统研究提供理论指导,为纤维素乙醇的研发奠定理论基础。