【摘 要】
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谷氨酸棒杆菌是一种从土壤中分离的、食品安全级的革兰氏阳性细菌,被广泛应用于氨基酸等产品的生产。近年来,随着合成生物学的发展,以谷氨酸棒杆菌为底盘的人工细胞工厂用于合成多种生物能源和精细化学产品越来越受到广泛关注。然而在发酵过程中会面临诸如高温、pH、有机溶剂、有毒副产物和机械损伤等多种不良因素,这些不良因素的胁迫会影响微生物细胞的正常生理功能,进而导致微生物细胞的转化效率降低和工业产品的产量降低。
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谷氨酸棒杆菌是一种从土壤中分离的、食品安全级的革兰氏阳性细菌,被广泛应用于氨基酸等产品的生产。近年来,随着合成生物学的发展,以谷氨酸棒杆菌为底盘的人工细胞工厂用于合成多种生物能源和精细化学产品越来越受到广泛关注。然而在发酵过程中会面临诸如高温、pH、有机溶剂、有毒副产物和机械损伤等多种不良因素,这些不良因素的胁迫会影响微生物细胞的正常生理功能,进而导致微生物细胞的转化效率降低和工业产品的产量降低。其中pH是影响微生物生长的重要因素。发酵过程中,pH调控不当会引起发酵体系pH的急剧波动,进而造成酸碱胁迫,极大影响到微生物细胞的生长及目标产物的积累。本文主要通过非理性的ARTP诱变和理性的合成生物学技术两个方面来实现谷氨酸棒杆菌对酸碱耐受和自我调控性并提高其鲁棒性,具体研究结果如下:（1）对谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum ATCC13032）进行ARTP诱变,然后通过高通量筛选得到能够耐受pH 5.0的菌株18株,耐受pH 11.0的菌株25株,通过实验室摇瓶复筛和传代稳定性的验证,最终得到一株可在pH 5.0条件下生长情况较好且较稳定的菌株icgTAC02,一株在pH 11.0条件下生长情况较好且较稳定的耐碱菌株icgTAI02。（2）在谷氨酸棒杆菌中,利用β-半乳糖苷酶对本课题组之前挖掘到的并在大肠杆菌（E.coli.k12）中进行了验证的酸碱响应型启动子P-asr、P-atp2进行了酸碱相应及强度表征,结果表明P-asr在pH 6.5时强度最高;P-atp2在pH 10.0时强度最高。（3）通过KEGG、NCBI等数据库挖掘了来自谷氨酸棒杆菌内源的产酸基因PQO、aceE、Idh和课题组已经验证过的产碱基因glsA、gad,通过合成生物学手段在谷氨酸棒杆菌中构建了pH智能调节基因线路。通过在不同pH条件下发酵结果可知,在具有碱性调控线路的工程菌株中,当pH为10.0时,Patp2-PQO、Patp2-aceE、Patp2-Idh能够迅速响应碱性环境并及时产酸来中和环境中的碱;在具有酸性调控线路的工程菌株中,当pH在6.5时,Pasr-glsA、Pasr-gadA能够迅速响应酸性环境并能够及时产碱来中和环境中的酸,来实现pH的自我智能调控。（4）为了验证这两条酸碱调控线路的的相容性,通过构建双质粒系统将酸碱调控线路整合到谷氨酸棒杆菌中,通过菌体生长情况及谷氨酸的产量来表征该调控线路的调控能力。结果表明,当不人为控制培养基的pH时,野生菌L-谷氨酸的产量为6.1 g/L,氨水的用量为15.0 mL;工程菌株的L-谷氨酸的产量为7.1 g/L,比野生菌提高了16.4%;氨水的用量11.0 mL,比野生菌减少了26.6%。说明构建的pH调控线路在发酵过程中有一定调控能力。
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