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实验目的：
阿特拉津(atrazine，ATR)是广泛应用的三嗪类除草剂之一，主要用于控制多种农作物周围的杂草，如玉米、甘蔗、茶园等田地。由于其化学结构稳定且化学反应性低，因此经过长期应用后，ATR容易残留在土壤、农产品、地下水和地表水中造成环境污染，对动植物造成伤害。ATR是一种潜在的内分泌干扰物，已有研究表明其会破坏成年和青春期雄性和雌性啮齿动物的生殖功能，然而其对胎儿睾丸间质细胞发育的影响尚不清楚。本实验的目的是研究妊娠期间子宫内暴露于ATR对胎鼠睾丸间质(Leydig)细胞的影响及其潜在机制。
实验方法：
将妊娠Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为4组：对照组（玉米油）、剂量组(25、50和100mg/kg的ATR，溶剂为玉米油)，每组6只。妊娠第12天时，剂量组分别灌胃25、50和100mg/kg的ATR，对照组灌胃玉米油。此后，每天给每只SD孕鼠称重记录，同时观察动物的活动状态。妊娠第21天左右，SD孕鼠自然分娩后取雄性仔鼠，称重，记录雌雄比，取仔鼠血清测睾酮，取出睾丸，分离每对睾丸，一侧睾丸用Bouins液浸泡，用苏木精一伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，H&E)测量多核原始生殖细胞(multinucleatedgonocytes，MNGs)比例；用免疫组织化学染色法分别对胎鼠Leydig细胞进行生物标记（胆固醇侧链裂解酶，CYPlIA1）和对支持(Sertoli)细胞进行生物标记（SRY相关高迁移率族群基因9，SOX9），之后分析测量胎鼠Leydig细胞和Sertoli细胞数目、细胞大小和细胞群分布；用免疫荧光对CYP11A1-Leydig细胞标记物和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)共染色后化学分析胎鼠Leydig细胞增殖情况。另一侧睾丸用米提取RNA，用实时荧光定量核酸扩增检测系统(quantitative real time polymerase chain reaction，qPCR)测量胎鼠Leydig细胞(Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3和Insl3)和Sertoli细胞(Fshr、Dhh、Amh和Sox9)基因表达水平；用Westernblotting法(WB)测量（CYP11A1，HSD3B1、HSD1783、FSHR、DHH和SOX9）的蛋白水平。上述的结果来共同探究宫内暴露于ATR对胎鼠Leydig细胞的影响及潜在机制。
实验结果：
动物实验研究发现，ATR暴露后，母鼠体重没有改变，其幼鼠体重和雌雄比例也不受影响。ATR不会增加雄性胎鼠睾丸中MNGs的发牛率。ATR呈剂量依赖性地降低雄性胎鼠的血清睾酮水平，在100mg/kg的剂量下，睾酮水平相对于对照组显著地降低。免疫组织化学染色结果显示，在ATR暴露后睾丸中CYPIIA1标记的Leydig细胞数日呈剂量依赖性地增加，并在最高剂量组中相较于对照组有显著性意义(P＜0.05)，这表明ATR影响了胎鼠Leydig细胞的发育。此外，观察到胎鼠Leydig细胞以单细胞或具有2个或者更多个细胞簇的形式分布在睾丸中。在本研究中，将胎鼠Leydig细胞的簇大小定义为单个（每个簇1个细胞），小的（每个簇2-4个细胞），中等（每个簇5-16个细胞）和大（每个簇＞16个细胞）群集。在ATR的影响下，中等和大型簇的百分比在100mg/kg的剂量下显著性增加，表明高剂量ATR会引起胎鼠Leydig细胞异常聚集。与对照组相比，SOX9标记的Sertoli细胞数目没有变化。CYP11A1(Leydig细胞标志物）和PCNA（增殖细胞标志物）双重染色标记了胎鼠Leydig细胞的增殖，结果发现100mg/kg的ATR剂量下，胎鼠Leydig细胞的PCNA标记指数上升，进一步表明ATR通过有丝分裂增加了胎鼠Leydig细胞的数量。在不调节细胞数量的情况下，ATR在50和／或100mg/kg时上调Cyp11a1，Hsd3b1，Insl3，Fshr和Sox9的基因表达，而在25-100mg/kg时下调Hsd17b3和Dhh的表达。调整胎鼠的Leydig和Sertoli细胞数后，ATR上调Fshr和Sox9的表达，下调Scarb1，Cyp17a1，Hsd17b3和Dhh的表达，而不会影响其他基因。ATR调节胎鼠Leydig细胞(CYP11A1和HSD3B1)以及Sertoli细胞(HSD1783、FSHR、DHH和SOX9)的蛋白表达水平，并证实了它们的mRNA水平。免疫组化的半定量检测中，观察到每个Leydig细胞CYP11A1的光密度不变，而Sertoli细胞SOX9的光密度增加。这些结果表明ATR影响Leydig细胞和Sertoli细胞的功能和发育。
实验结论：
ATR增加了胎鼠Leydig细胞的数量，但通过影响Sertoli细胞中DHH的分泌而抑制了胎鼠Leydig细胞的功能。与Sertoli细胞中HSD1783的下调一起，胎鼠Leydig细胞的成熟迟缓导致子宫内ATR暴露后睾酮生成减少。
阿特拉津(atrazine，ATR)是广泛应用的三嗪类除草剂之一，主要用于控制多种农作物周围的杂草，如玉米、甘蔗、茶园等田地。由于其化学结构稳定且化学反应性低，因此经过长期应用后，ATR容易残留在土壤、农产品、地下水和地表水中造成环境污染，对动植物造成伤害。ATR是一种潜在的内分泌干扰物，已有研究表明其会破坏成年和青春期雄性和雌性啮齿动物的生殖功能，然而其对胎儿睾丸间质细胞发育的影响尚不清楚。本实验的目的是研究妊娠期间子宫内暴露于ATR对胎鼠睾丸间质(Leydig)细胞的影响及其潜在机制。
实验方法：
将妊娠Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为4组：对照组（玉米油）、剂量组(25、50和100mg/kg的ATR，溶剂为玉米油)，每组6只。妊娠第12天时，剂量组分别灌胃25、50和100mg/kg的ATR，对照组灌胃玉米油。此后，每天给每只SD孕鼠称重记录，同时观察动物的活动状态。妊娠第21天左右，SD孕鼠自然分娩后取雄性仔鼠，称重，记录雌雄比，取仔鼠血清测睾酮，取出睾丸，分离每对睾丸，一侧睾丸用Bouins液浸泡，用苏木精一伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，H&E)测量多核原始生殖细胞(multinucleatedgonocytes，MNGs)比例；用免疫组织化学染色法分别对胎鼠Leydig细胞进行生物标记（胆固醇侧链裂解酶，CYPlIA1）和对支持(Sertoli)细胞进行生物标记（SRY相关高迁移率族群基因9，SOX9），之后分析测量胎鼠Leydig细胞和Sertoli细胞数目、细胞大小和细胞群分布；用免疫荧光对CYP11A1-Leydig细胞标记物和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)共染色后化学分析胎鼠Leydig细胞增殖情况。另一侧睾丸用米提取RNA，用实时荧光定量核酸扩增检测系统(quantitative real time polymerase chain reaction，qPCR)测量胎鼠Leydig细胞(Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3和Insl3)和Sertoli细胞(Fshr、Dhh、Amh和Sox9)基因表达水平；用Westernblotting法(WB)测量（CYP11A1，HSD3B1、HSD1783、FSHR、DHH和SOX9）的蛋白水平。上述的结果来共同探究宫内暴露于ATR对胎鼠Leydig细胞的影响及潜在机制。
实验结果：
动物实验研究发现，ATR暴露后，母鼠体重没有改变，其幼鼠体重和雌雄比例也不受影响。ATR不会增加雄性胎鼠睾丸中MNGs的发牛率。ATR呈剂量依赖性地降低雄性胎鼠的血清睾酮水平，在100mg/kg的剂量下，睾酮水平相对于对照组显著地降低。免疫组织化学染色结果显示，在ATR暴露后睾丸中CYPIIA1标记的Leydig细胞数日呈剂量依赖性地增加，并在最高剂量组中相较于对照组有显著性意义(P＜0.05)，这表明ATR影响了胎鼠Leydig细胞的发育。此外，观察到胎鼠Leydig细胞以单细胞或具有2个或者更多个细胞簇的形式分布在睾丸中。在本研究中，将胎鼠Leydig细胞的簇大小定义为单个（每个簇1个细胞），小的（每个簇2-4个细胞），中等（每个簇5-16个细胞）和大（每个簇＞16个细胞）群集。在ATR的影响下，中等和大型簇的百分比在100mg/kg的剂量下显著性增加，表明高剂量ATR会引起胎鼠Leydig细胞异常聚集。与对照组相比，SOX9标记的Sertoli细胞数目没有变化。CYP11A1(Leydig细胞标志物）和PCNA（增殖细胞标志物）双重染色标记了胎鼠Leydig细胞的增殖，结果发现100mg/kg的ATR剂量下，胎鼠Leydig细胞的PCNA标记指数上升，进一步表明ATR通过有丝分裂增加了胎鼠Leydig细胞的数量。在不调节细胞数量的情况下，ATR在50和／或100mg/kg时上调Cyp11a1，Hsd3b1，Insl3，Fshr和Sox9的基因表达，而在25-100mg/kg时下调Hsd17b3和Dhh的表达。调整胎鼠的Leydig和Sertoli细胞数后，ATR上调Fshr和Sox9的表达，下调Scarb1，Cyp17a1，Hsd17b3和Dhh的表达，而不会影响其他基因。ATR调节胎鼠Leydig细胞(CYP11A1和HSD3B1)以及Sertoli细胞(HSD1783、FSHR、DHH和SOX9)的蛋白表达水平，并证实了它们的mRNA水平。免疫组化的半定量检测中，观察到每个Leydig细胞CYP11A1的光密度不变，而Sertoli细胞SOX9的光密度增加。这些结果表明ATR影响Leydig细胞和Sertoli细胞的功能和发育。
实验结论：
ATR增加了胎鼠Leydig细胞的数量，但通过影响Sertoli细胞中DHH的分泌而抑制了胎鼠Leydig细胞的功能。与Sertoli细胞中HSD1783的下调一起，胎鼠Leydig细胞的成熟迟缓导致子宫内ATR暴露后睾酮生成减少。