一、大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、表型分析与体外标记目的：本研究旨在对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行体外分离培养和纯化,并对其生物学特性进行初步鉴定,以期为后序实验提供实验依据及为开展细胞治疗获取足量的细胞数。方法：1.取2月龄SD大鼠,无菌条件下取出双侧股骨和胫骨,低糖DMEM培养液冲洗骨髓腔获取骨髓细胞悬液。将骨髓液加入密度梯度为1.077的Ficoll淋巴细胞分离液采用密度梯度离心法分离纯化单个核细胞。离心后吸取含云雾状细胞的白膜层液体用含胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养液制成细胞悬液,移入培养瓶中,置于培养箱内进行培养。细胞培养48小时后进行半量换液,此后每隔3天进行全量换液。细胞呈集落样生长,待细胞覆盖培养瓶底面积的80%以上,用胰酶消化,并收集细胞用含FBS的低糖型DMEM培养基进行传代培养。本实验选用3代后的BMSCs进行实验。2.大鼠BMSCs的表型鉴定：胰酶消化收集约5×105个骨髓间充质干细胞,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次,悬浮于封闭液中,加入抗人CD29,CD90,CD34,CD45一抗40℃孵育30分钟,PBS洗涤细胞,加入经异硫氰酸荧光素(FITC)荧光标记的二抗,孵育,洗涤后重悬于PBS溶液进行流式细胞仪检测细胞表型。实验中采用同种属,同表型的相关抗体作为对照。3.大鼠BMSCs的体外标记：将二甲基亚砜(DMSO)溶解的膜荧光染料CM-DiI溶液加入到经PBS清洗的贴壁干细胞培养瓶中标记,混匀后静置于孵育。将标记好的1-5×105个细胞用PBS溶液冲洗后,重新收集悬浮于100μL生理盐水冰上保存备用,荧光显微镜下观察细胞的体外标记率。结果：1.培养细胞的形态学观察：刚接种的细胞镜下呈大小较均一的圆形；培养72小时后,细胞的形态多数为梭形；培养5-7天后,细胞呈较大的扁平样或纺锤样,7天左右细胞覆盖培养瓶底面积的80%以上。传代培养后细胞形态均一,呈梭形。2.培养细胞的免疫表型测定：所培养细胞表面抗原标志物可阳性表达CD90和CD29；阴性表达CD34和CD45。3.培养细胞的荧光标记情况：BMSCs应用膜荧光染料CM-DiI标记后呈红色,在荧光显微镜下观察标记率达80%以上。结论：采用密度梯度离心法和贴壁筛选法相结合的方法可体外获得生长状态良好的,具有较高活性的大鼠BMSCs;在体外培养、传代后可获得足量的、分化功能良好的、高纯度的BMSCs。二、骨髓间充质干细胞移植治疗肺动脉高压的研究目的：研究BMSCs移植治疗野百合碱(MCT)诱导的肺动脉高压(PAH)大鼠模型的可行性并初步探讨其作用机制。方法：1.肺动脉高压模型的建立及评价取清洁级雄性SD大鼠20只,随机分为PAH模型组(模型组)和正常对照组(对照组)。模型组每只大鼠一次性腹腔注射MCT60mg/kg,建立PAH模型。对照组腹腔注射等量0.9%生理盐水代替MCT,同等条件下饲养动物。注射MCT1周后,称重并麻醉大鼠,将3F右心导管沿右侧颈静脉插入右心室及肺动脉,测量并记录右心室收缩压(VSP)、平均右室压(MRVP)、平均肺动脉压(MPAP)等血流动力学参数。测压后处死动物,取左侧肺脏下叶组织固定、脱水、切片,苏木素伊红(HE)染色,光学显微镜下观察,电子计算机图像分析仪对各组切片中的肺小动脉进行图像分析。测量与终末细支气管伴行的肺小动脉管壁中膜厚度(MT)、血管外径(ED)、肺小动脉管腔面积(VA)以及血管总面积(TAA),分别计算MT与ED的比值(MT%),VA与TAA比值(VA%),计算均值作为大鼠的肺血管形态计量学指标。处死动物同时快速取出心脏,分离心脏右心室游离壁(RV),滤纸吸水,电子天平称重,并计算右心室与体重(BW)之比(RV/BW)来评估右心室重量变化,确定有无右室肥厚。根据血流动力学参数、右心室肥厚程度、肺小动脉管壁病理改变评价肺动脉高压模型建立是否成功。2.实验动物分组雄性SD清洁级大鼠30只,随机分为3组(n=10)。BMSCs移植治疗组(BMSCs组),PAH模型组(PAH组),生理盐水阴性对照组(盐水对照组)。3. BMSCs对大鼠PAH模型的作用BMSCs对MCT诱导右心室损伤的影响：BMSCs移植后继续饲养动物3周,麻醉大鼠,经右侧颈静脉插入3-FrMiller导管进入右心室及肺动脉,接压力换能器,经多导生理记录仪测量RVSP、MRVP、MPAP等血流动力学参数。实验结束前处死动物取出心脏,测定RV/BW。BMSCs体内存活及转化的检测：处死实验动物后取出肺脏放于折叠锡纸中,冷冻保存。切片,固定。通过观察CM-DiI标记的BMSCs是否发出红色荧光判断细胞存活情况。冰冻切片组织滴加正常羊血清封闭液室温封闭,分别滴加山羊抗小鼠肺表面活性物质相关蛋白C (SP-C)单克隆抗体、兔抗人血管性血友病因子(vWF)和血管内皮生长因子(VEGF)抗体,放置于湿盒中4℃保存过夜,PBS洗涤,分别滴加FITC标记的山羊抗兔IgG,孵育,洗涤后,滴加Na2C03-甘油封片,于激光共聚焦显微镜下观察结果,并以100-400倍放大率选取典型视野照相。各组大鼠肺血管管壁结构比较：取左下肺组织块,常规石蜡包埋,在左肺门水平横切,组织切片行HE染色,用图像分析仪观察肺小动脉病变。结果：1.动物一般情况及存活率：大鼠腹腔注射MCT1周后,进食及活动减少,反应迟钝,毛发晦涩无光泽,呼吸急促,消瘦,体重下降或不增。而BMSCs移植3周后大鼠上述特征不明显,一般情况良好。2.PAH模型的相关检测结果.2.1肺大体病理形态：大鼠腹腔注射MCT1周后,模型组动物肺脏大体观察可见体积较正常对照组明显肿大,颜色紫红,表面凹凸不平,弹性差,局部可见瘀血。2.2MCT诱导的血流动力学参数变化及右心室的损伤：注射MCT1周后,大鼠血流动力学参数变化：模型组与对照组相比RVSP、MRVP、MPAP明显升高(P<0.05),RV/BW明显增大(P<0.05),提示腹腔注射MCT60mg/kg建立大鼠PAH模型成功。2.3肺血管管壁结构的改变：光镜下观察：模型组与对照组相比肺小动脉管壁明显增厚,管腔狭窄。经测量计算MT%：模型组较对照组明显增加(P<0.05)；VA%：模型组较对照组明显减少(P<0.05)。3. BMSCs对MCT诱导的PAH影响3.1血流动力学参数与右心室损伤的影响：BMSCs移植3周后,BMSCs组与PAH组相比RVSP、MRVP、MPAP均明显改善。RV/BW比例测定(g/kg)PAH组与盐水对照组相比明显增加(P<0.01),而BMSCs组与PAH组相比具有显著改善作用(P<0.05)。3.2肺血管管壁结构变化：PAH组与盐水对照组相比肺小动脉管壁明显增厚,管腔狭窄；BMSCs组比PAH组管壁增厚及管腔狭窄程度减轻。经测量计算MT%：PAH组较盐水对照组明显增加(P<0.01),而BMSCs组则比PAH组显著降低(P<0.05)；VA%：PAH组较盐水对照组明显减少(P<0.01),而BMSCs组则比PAH组显著增加(P<0.05)。4.移植细胞存活及转化的鉴定移植3周后镜下观察,BMSCs组可见红色荧光,盐水对照组及PAH组未见红色荧光,说明移植3周后BMSCs仍然存活。盐水对照组,PAH组及BMSCs组部分区域经SP-C、vWF和VEGF标记后均可见到绿色荧光。对BMSCs组图像进行叠加分析显示切片经VEGF及vWF标记后的绿色荧光与DiI标记的红色区域可被叠加成黄色荧光,而SP-C荧光标记的部分未发现能与红色荧光相重叠的现象。说明BMSCs有转化为血管内皮细胞的可能。结论：1.体外培养的BMSCs经静脉移植入体内3周后仍处于存活状态,并可能转化为肺血管内皮细胞。2.静脉移植BMSCs可明显减轻甚至逆转MCT诱导的PAH的进程,明显改善心功能及血流动力学指标。