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髓样分化蛋白-2(myeloid differential protein，MD-2)是Toll样受体(Toll likereceptors, TLRs)与脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)结合的受体分子之一，作为天然免疫识别的重要调控分子，在脂多糖信号转导过程中扮演重要角色。新近研究认为MD-2是LPS活化TLR4跨膜信号通路所必需的受体分子，抑制其对该通路的活化作用是防治LPS诱导的脓毒症的有效策略。分泌型MD-2(soluble myeloid differential protein2,sMD-2)的远距作用已被人们发现，表明MD-2在细胞膜上相互作用位点并不是唯一的，寻找新的MD-2的相互作用位点/作用蛋白对于防治内毒素诱导的过度炎症反应具有重要的理论意义和潜在应用价值。项目组在前一个基金项目(No.30700289)研究中基于MD-2结构与功能的关系，设计构建了1条新的来源于MD-2两个独特的功能结合域的模拟肽(MD-2mimeticpeptide，MDMP)，其氨基酸序列为：CHGHDDDYSFCFSFEGILFPKGHYR，包括MD-2与TLR4的结合域(Cys95-Cys105)及MD-2与LPS的结合域(Phe119-Lys132)，并初步证明MDMP在体外和体内可有效地抑制LPS诱导的过度炎症反应。在前期研究的基础上本课题针对MDMP的分子结构特点进行了进一步的研究，通过9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成法合成了MDMP及其衍生肽：包括用于细胞定位的FITC-MDMP及用于Pull Down钓取MDMP相互作用位点的6XHis-MDMP，探讨其在RAW264.7细胞膜上的定位特征，并经His-Pull Down、Tricine-SDS-PAGE电泳及ESI-Q-TOF质谱鉴定，获取其在RAW264.7细胞膜上的相互作用蛋白，深入研究MDMP拮抗内毒素诱发的过度炎症反应的可能机制。此外，为了进一步在人源性巨噬细胞模型上钓取MDMP的相互作用蛋白，拟用豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)诱导THP-1分化为人源性成熟巨噬细胞作为细胞模型，验证MDMP相互作用蛋白及作用位点在人体细胞上的效应是否一致。鉴于目前通过PMA诱导THP-1分化为成熟巨噬细胞的方法尚未有统一标准，为建立稳定可靠的有利于模拟内毒素诱发过度炎症的THP-1源性巨噬细胞模型，我们对该诱导过程进行了部分优化，并对PMA在诱导TPH-1成为成熟人源巨噬细胞的过程中对MD-2的表达、定位及细胞因子TNF-α、IL-6分泌的影响进行检测分析，为下一步在人体细胞上研究MDMP的效应和机制奠定基础。主要实验方法与研究结果：1.采用EasyModeller软件以MD-2为模板，基于同源建模的系统理论原理直观地获取MDMP的空间结构，并进行了能量优化，初步发现模拟结构能较好展示MD-2模拟肽（MDMP）的二、三级结构；通过激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanningmicroscope，CLSM)观察到FITC-MDMP明确定位在RAW264.7细胞膜上。2.通过改进和优化His-Pull Down实验技术条件获取MDMP在RAW264.7细胞膜上的相互作用蛋白，Tricine-SDS-PAGE电泳进行相互作用蛋白的分离，考马斯亮蓝染色显示有差异性条带；进一步经ESI-Q-TOF质谱鉴定差异条带蛋白，通过http://www.uniprot.org/蛋白质数据库网站分析质谱数据结果，初步筛选鉴定可能性较大的相互作用蛋白包括CH60(60kDa heat shock protein)，S10A4(Protein S100-A4)，RAB10(Ras-related protein Rab-10)， IRAK2(Interleukin-1receptor-associated kinase-like2)，ILRL1(Interleukin-1receptor-like1)，MSRE (Macrophage scavenger receptor types Iand II)等。3. PMA梯度剂量(1~100ng/ml)均可成功诱导THP-1细胞成熟分化为人源巨噬细胞，RT-qPCR和Western blot检测诱导成熟THP-1细胞源巨噬细胞MD-2mRNA及蛋白表达量较诱导前均显著升高(P<0.01)，ELISA检测THP-1细胞诱导后细胞培养上清中的TNF-α、IL-6分泌水平随PMA诱导浓度依次显著增加(P<0.01)，sMD-2仅诱导前后有明显统计学差异(P<0.01)；激光扫描共聚焦显微镜观察MD-2分布，发现PMA诱导后MD-2蛋白表达较诱导前显著增加，诱导剂量组之间无显著差异。主要结论：1.同源建模的系统理论构建出MDMP有其独特的二、三级空间构象，可为后续相互作用位点的研究提供理论依据；激光共聚焦扫描显微镜准确展示了MDMP在小鼠源性巨噬细胞RAW264.7细胞膜上的定位特征。2.改进和优化的His-Pull Down实验结合Tricine-SDS-PAGE电泳分离差异条带及ESI-Q-TOF质谱筛选鉴定，成功获取到MDMP在RAW264.7细胞膜上的相互作用蛋白，表明MDMP拮抗内毒素诱导的过度炎症的作用位点并不单一，可能存在多个作用蛋白位点和多种作用方式。3.低浓度剂量(1ng/ml)PMA即能有效的建立人源性THP-1巨噬细胞模型，对巨噬细胞膜受体MD-2等的结构性表达无明显影响，且不会增加炎症因子TNF-α、IL-6的基础分泌水平，有利于MDMP拮抗内毒素效应及其机制研究。