本文主要从以下几部分进行了研究： 第一部分： 背景： 革兰阴性细菌是儿童社区和医院感染的重要细菌病原，近年来革兰阴性菌耐药菌株感染已成为临床面临的巨大困难之一。抗菌药物不合理使用和细菌耐药对儿童的影响尤为突出，目前我国尚缺乏较大范围儿科细菌性感染病原耐药与抗菌药物使用调查。 目的： 通过调查2000～2006年我国住院儿童临床分离大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单孢菌对抗菌药物耐药状况及同期抗菌药物使用情况，了解我国儿童常见革兰阴性细菌耐药状况及儿科抗菌药物使用特点，为儿科合理使用抗菌药物，有效控制这些病原引起的感染提供依据。 方法： 连续收集首都医科大学附属北京儿童医院、上海交通大学附属上海儿童医院、复旦大学附属儿科医院、重庆医科大学附属重庆儿童医院以及广州医学院附属广州儿童医院国内5家大型儿童专科医院2000～2006年住院儿童临床分离大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单孢菌三种革兰阴性菌对常用抗菌药物耐药数据，并采用世界卫生组织(World health organization，WHO)解剖、治疗、化学(Anatomical Therapeutical Chemical Classification，ATC)药物分类法，调查上述医院同期住院儿童抗菌药物使用状况，分析细菌耐药率变化与抗菌药物用药频度相关性。 结果： (1)2000～2006年儿科分离大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对亚胺培南保持高度敏感，对氨苄西林耐药率最高，平均超过80％；对第三代头孢菌素、第四代头孢菌素的耐药率及产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)比率呈上升趋势，2006年分别为47.0％和55.3％；对青霉素及β-内酰胺酶抑制剂复合制剂敏感性高于青霉素类抗菌药物。铜绿假单孢菌对各抗菌药物耐药率未见增高趋势，对亚胺培南及头孢哌酮和舒巴坦复合制剂耐药率均低于10％，对环丙沙星耐药率最低，平均为3.3％。 (2)青霉素类、头孢菌素类及大环内酯类抗生素构成住院患儿抗菌药物用药频度的80％左右，其中以头孢菌素类最高，约占总总抗菌药物用药频度的30％～40％；其次为青霉素类，波动于10％～40％；大环内酯类约为10％。头孢菌素类抗生素中，第三代头孢菌素用药频度最高。氨基糖甙类、糖肽类、磺胺类、喹诺酮类等其他抗菌药始终维持在较低水平。 (3)大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌及铜绿假单孢菌对常用抗菌药物耐药率变化与相应抗菌药物用药频度之间均无相关性(P>0.05)。2000～2006年大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌产生：ESBL比率与同期头孢菌素类用药频度变化趋势一致。 结论： 2000～2006年儿科分离大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌产生ESBL比率及其对头孢菌素类抗生素耐药率呈上升趋势，铜绿假单孢菌对各抗菌药物耐药率未见增高趋势。抗菌药物使用是影响儿科分离菌株耐药的重要影响因素，大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌产生ESBL比率与头孢菌素类用药频度变化趋势一致。 第二部分： 背景： 随着喹诺酮类药物的广泛使用，细菌对喹诺酮类药物耐药性逐渐增加，染色体介导的靶位点拓扑异构酶的改变和细胞内药物蓄积的减少是喹诺酮类耐药的两种主要机制。20世纪未首次在肺炎克雷伯菌临床分离株中发现质粒介导的喹诺酮耐药基因qnr，目前己在不同革兰阴性菌属中发现，大多存在于肠杆菌科细菌，已有研究表明qnr基因与超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBL)及耐氨苄西林头孢菌素酶(AmpC)基因密切相关，均可通过质粒传播，常表现为多重耐药。抗菌药物使用造成的选择压力是细菌耐药产生的主要原因，喹诺酮类药物在我国应用极为广泛，但喹诺酮类药物在儿童的应用极其有限。国内外尚缺乏较大范围儿科临床分离肠杆菌中质粒介导喹诺酮耐药流行病学研究。 目的： 通过PCR方法检测我国儿科临床分离肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌株中质粒介导喹诺酮耐药基因qnr，了解儿科常见肠杆菌中质粒介导喹诺酮耐药流行病学特点，为临床抗菌药物使用和细菌耐药控制提供依据。 方法： 1.收集2005年1月～2006年12月国内五家儿童医院临床分离头孢噻肟和/或头孢他啶耐药的肺炎克雷伯菌578株，大肠埃希菌334株。采用药敏纸片法分别筛选产生ESBL和/或AmpC及环丙沙星耐药菌株。 2.应用PCR方法调查qnrA、qnrB及qnrS在上述菌株中的流行和分布，PCR产物进行测序与GenBank内相应基因序列比较。并应用琼脂稀释法检测qnr阳性菌株对常用抗菌药物最小抑菌浓度(MIC)。 3.以qnr阳性菌株为供体菌，以耐叠氮钠的大肠埃希菌J53为受体菌进行接合实验，观察喹诺酮耐药性传递情况。 4.PCR方法检测qnr阳性肺炎克雷伯菌株中ESBL及AmpC基因类型，并利用肠杆菌科重复序列PCR(ERIC-PCR)方法进行qnr阳性菌株DNA同源性分析。 结果： 1.qnr基因流行和分布 351株产ESBL或AmpC肺炎克雷伯菌中，84株(23.9％)携带qnr基因，其中qnrA 7株，qnrB 16株，qnrS 57株，同时携带qnrA，qnrB 3株，同时携带qnrB，qnrS 1株。qnrA，qnrB，qnrS基因阳性率分别为2.3％，5.7％和16.5％。 211株肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌环丙沙星耐药株中有19株为qnr阳性菌株(8.0％)，其中qnrA 2株，qnrB 5株，qnrS 6株，同时携带qnrA和qnrB 4株，同时携带qnrB和qnrS 1株，同时携带qnrA，qnrB和qnrS 1株。 2.qnr阳性菌株对常用抗菌药物敏感性 qnr阳性菌株对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁及氨曲南的耐药率超过90％；对头孢吡肟的耐药率为86.9％；对环丙沙星、氧氟沙星的耐药率分别为73.8％和60.8％；对阿米卡星和庆大霉素的耐药率分别为40％和72.6％；所有qnr阳性菌株对亚胺培南敏感。 3.qnr基因传递 接合实验结果显示，接合菌均携带与其供体菌一致的qnr基因，与受体菌比较，接合菌对环丙沙星的MIC值增加了16～256倍，对氧氟沙星的MIC值增加2～32倍。 4.qnr阳性菌株中ESBL或AmpC基因检测 71株(84.5％)qnr阳性产ESBL或AmpC肺炎克雷伯菌扩增到至少一种ESBL或AmpC基因，以qnrS与DHA-1型AmpC基因最常见(17株，20.2％)，其次为qnrB与DHA-1型AmpC基因(12株，14.3％)，19株(22.6％)携带2种或2种以上ESBL或AmpC基因。 5.qnr基因阳性菌株DNA同源性分析 ERIC-PCR结果显示，57株qnrS阳性肺炎克雷伯菌中，6株具有相同条带，可能属于相同克隆，但这些菌株分别来源于不同医院，其中2株来源于同一家医院的不同年份。其余菌株条带差异均在2条以上，可能属于不同的克隆株。 结论： 1.2005～2006年儿科分离肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中存在质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrA，qnrB及qnrS，以qnrS为主。肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产ESBL或AmpC菌株中qnr的携带率为23.9％，环丙沙星耐药株中qnr的携带率为9％。 2.多数qnr阳性菌株至少同时携带一种ESBL或AmpC基因。所有qnr阳性对亚胺培南敏感，对青霉素及头孢菌素类耐药比率较高。 3.儿科分离qnr阳性肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌大多属于不同的克隆株。