目的:Alzheimer病（Alzheimer disease, AD）是最常见的神经变性疾病。尽管其病因、发病机制仍不明,但已确定Aβ的产生与沉积是引发AD的重要机制。大量研究证实Aβ_25～35注射到大鼠海马内可导致海马神经元丢失和学习记忆障碍等类AD的表现。葛根素（Puerarin）是从豆科葛属植物野葛的干燥根中提取的一种黄酮甙类（Flavonol Glycoside）天然药物单体,具有广泛的药理作用,但葛根素对AD的防治功效尚未确定。本研究拟应用Aβ_25～35注射到Wistar大鼠海马内模拟海马神经元丢失和学习记忆障碍等类AD的表现。研究葛根素能否改善Aβ_25～35诱导的大鼠学习记忆障碍,并对其作用机制进行探讨。方法与结果:1葛根素对Aβ诱导的大鼠学习记忆能力的影响用Morris水迷宫试验来评测Wistar大鼠学习记忆能力。在定位导航试验中,随着训练次数的增加,所有大鼠寻找水下平台的平均逃避潜伏期（the average escape latency, AEL）越来越短,表明所有大鼠均具有通过训练学习,对水下的平台的空间定位获得认知并产生记忆的能力。5天训练期间的前3天,Aβ组与对照组比较大鼠平均AEL明显延长,差别具有统计学意义（P<0.05）,提示Aβ_25³5海马注射导致Aβ组大鼠学习记忆能力障碍;葛根素组与Aβ组比较AEL减短,差别有统计学意义（P<0.05）,而葛根素组大鼠的AEL与对照组大鼠比较,两者之间的差异不具有统计学意义（P>0.05）,提示葛根素治疗能改善Aβ_25³5海马注射诱导的Wistar大鼠学习记忆能力障碍。训练后2天所有大鼠认知和记忆能力接近达稳定水平,各组AEL比较差别不具有统计学意义（P>0.05）。空间探索试验中,Aβ组大鼠多围绕池壁游泳,在迷宫外环停留时间较长,对照组和葛根素组大鼠多在原水下平台所在象限内徘徊。Aβ组与对照组相比跨平台次数明显减少（P<0.05）;而在葛根素组大鼠的跨平台次数比Aβ组明显增加（P<0.05）。提示Aβ海马注射导致大鼠空间记忆力下降,葛根素治疗能减轻Aβ诱导的大鼠空间记忆力下降。这一结果也与上述定位导航试验结果相互印证。2葛根素对Aβ诱导的大鼠海马炎性反应的干预效应HE染色后观察,对照组Wistar大鼠海马的锥体细胞带结构完整、清晰,神经元呈多层,排列规则、整齐、紧密。神经元胞浆边界清晰,胞核呈圆形,饱满清晰,核仁明显。Aβ组大鼠海马显示明显的炎性反应:海马锥体细胞带结构紊乱,层数减少,层次不清,锥体细胞带间及周围聚集大量炎性细胞,甚至有的出现“断带”现象:一段的锥体细胞带中的神经元全部丢失,被大量炎性细胞和细胞碎片所取代。神经元数目减少,分布不均匀,有疏有密,大小不一,形态异常,有的胞浆、胞核边界不清,有的着色深,有的着色浅,甚至“空泡化”。葛根素组大鼠海马的炎性反应轻微:海马锥体细胞带仍保持结构完整性,但有的出现细胞层数减少,层次混乱,可见少量炎性细胞浸润,存在神经元形态异常,“空泡化”现象少见。嗜银染色光镜下观察,对照组大鼠海马神经纤维密集,走行有规律,排列清晰整齐;Aβ组大鼠海马神经纤维间隙扩大,有的神经纤维变粗或粗细不等,排列紊乱,着色深浅不一;葛根素组大鼠海马神经纤维排列较整齐,与对照组接近。在光镜下,计数HE染色后海马锥体细胞带上的神经元数目分析比较,Aβ组与对照组比较神经元数目明显减少（P<0.05）,而葛根素组与Aβ组比较此数目明显增加（P<0.05）。提示葛根素治疗保护海马神经元,避免Aβ诱导的神经元丢失,可能是葛根素改善Aβ诱导的Wistar大鼠学习记忆障碍的病理学机制之一。受损伤的、功能异常的神经元在尼氏染色后胞浆内尼氏体数量减少、模糊甚至消失。计数大鼠海马尼氏体减少、模糊或消失的神经元的数目分析比较,Aβ组与对照组比较,此数目明显增加（P<0.05）,而葛根素组与Aβ组比较,此数目明显减少（P<0.05）。提示葛根素治疗不仅防止Aβ诱导的神经元丢失,也保护神经元具有正常的结构和功能,减弱Aβ诱导的神经元损伤。神经原纤维缠结（neurofibrillary tangle, NFT）是AD的特征性病理学表现。在HE染色和嗜银染色时均发现NFT。计数嗜银染色后海马含NFT的神经元的数目进行比较分析。对照组海马锥体细胞带上可发现的含NFT的神经元很少,Aβ组明显增多（P<0.05）,容易找到,葛根素组较Aβ组明显减少（P<0.05）。电镜下观察大鼠海马神经元的超微结构变化,应用一个评分标准对神经元炎性损伤进行评分比较。对照组大鼠海马神经元炎性损伤轻微,Aβ组大鼠海马神经元炎性损伤明显加重（P<0.05）,而葛根素治疗对Aβ诱导的大鼠海马神经元炎性损伤有明显的改善作用（P<0.05）。这些结果提示,海马注射Aβ_25-35诱导的强烈的炎性反应可能是Aβ_25-35诱导的学习记忆障碍的病理学基础,而葛根素改善Aβ_25-35诱导的学习记忆障碍的一个重要的病理学机制可能是通过抑制Aβ诱导的海马强烈的炎性反应实现的。3葛根素抑制Aβ诱导的海马炎性反应的分子机制转录因子核因子-κB（nuclear factor-kappaB, NF-κB）信号通路在AD脑中的炎性反应中发挥着重要作用。核内NF-κB的p65亚单位的表达水平可显示NF-κB的活化程度。免疫组织化学染色显示,p65亚单位的免疫反应阳性颗粒位于胞浆和胞核内。对照组大鼠海马神经元p65亚单位的阳性细胞少,着色浅。Aβ组较对照组显著增多,着色深。葛根素组较Aβ组海马神经元p65亚单位的免疫阳性细胞明显减少,着色浅。用Western blot分析的方法显示大鼠海马组织p65亚单位的表达,对照组的核p65亚单位蛋白条带浅、细,Aβ组较对照组蛋白条带明显加深、加粗,而葛根素组较Aβ组明显变浅、细。蛋白条带用Bio ID数码成像分析系统进行定量得到相对密度比值量进行定量分析。结果显示,在对照组p65亚单位的核内表达水平很低,在Aβ组大鼠海马p65亚单位表达量显著增加（P<0.01）,而在葛根素组Aβ诱导的p65亚单位核内表达量的增加被抑制（P<0.05）,提示NF-κB信号通路在海马注射Aβ25-35导致学习记忆障碍的过程中被激活,葛根素则抑制NF-κB信号通路的激活。NF-κB的激活可能通过上调炎性相关诱导酶环氧化合酶2（Cyclo-Oxygenase-2 COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase iNOS）的表达介导对神经元的损害。用免疫组化染色来明确海马神经元COX-2和iNOS的表达定位。对照组COX-2的免疫组化染色阳性细胞很少能见到。Aβ组COX-2的免疫反应阳性细胞显著增多,着色深,细胞内的阳性颗粒多,主要位于胞浆内。葛根素组可见到少量COX-2的免疫反应阳性细胞,与Aβ组相比数量少且着色浅。使用Western blot分析的方法更准确的定量分析。结果显示,对照组COX-2的表达水平很低。Aβ组大鼠海马COX-2蛋白表达量显著增加（P<0.01）。葛根素组较Aβ组COX-2蛋白表达量减少（P<0.05）。这提示葛根素治疗可能抑制Aβ诱导的海马神经元内COX-2的表达增加。iNOS的免疫反应阳性颗粒定位于胞浆。对照组几乎没有iNOS免疫组化染色阳性细胞。Aβ组海马可见大量iNOS免疫组化染色阳性的神经元。葛根素组与Aβ组相比,染色阳性的神经元较少。Western blot分析显示,对照组iNOS蛋白表达量处于低水平,Aβ组与之比较显著增加（P<0.01）,葛根素组较Aβ组iNOS蛋白表达量下降了（P<0.05）。提示Aβ诱导的iNOS表达增强可能被葛根素所抑制。4葛根素对Aβ诱导的大鼠海马神经元凋亡的干预效应及其作用机制HE染色可观察到大鼠海马锥体细胞带上的神经元凋亡,表现为细胞体积缩小,呈多角形、三角形、长条形或纺锤形,胞核与胞浆均浓缩深染,或散在或聚集成团,以CA1区和CA3区多见。对照组神经元凋亡少见,散在,Aβ组多见,常聚集成团,有的完全占据海马锥体细胞带的一段。葛根素组介于二者之间。TUNEL染色时上述形态的神经元大部分呈TUNEL染色阳性,证实为神经元凋亡。计数TUNEL阳性的神经元进行比较,对照组TUNEL染色阳性的神经元少见,Aβ组与对照组比较TUNEL染色阳性的神经元数量明显增加（P<0.05）,葛根素组与Aβ组比较TUNEL染色阳性的神经元数量明显减少（P<0.05）。流式细胞术测定的大鼠海马神经元凋亡细胞率,结果显示,对照组大鼠海马的凋亡细胞率处于较低水平,Aβ组较对照组凋亡细胞率明显增加（P<0.05）,葛根素组较Aβ组凋亡细胞率明显降低（P<0.05）。提示Aβ_25³5海马注射可诱导大鼠海马神经元凋亡,葛根素对其有抑制作用。免疫组织化学染色显示,BAX蛋白免疫组织化学染色阳性颗粒定位于神经元胞浆。对照组大鼠海马BAX蛋白免疫反应阳性的神经元少见,Aβ组与对照组比较BAX免疫反应阳性的神经元明显增加,着色更深,葛根素组与Aβ组比较BAX免疫反应阳性的神经元明显减少,着色变浅。Western blot对大鼠海马组织BAX的表达量进行定量分析,Aβ组比对照组大鼠海马组织BAX的表达量明显增加（P<0.05）,葛根素组与Aβ组相比BAX的表达量明显降低（P<0.05）。免疫组织化学染色检测bcl-2在大鼠海马的蛋白表达,结果显示,对照组BCL-2蛋白在大鼠海马组织有一定的基础表达量,免疫反应阳性颗粒定位于胞浆,Aβ组BCL-2阳性的神经元比对照组明显减少,着色浅;葛根素组与Aβ组比较BCL-2阳性的神经元明显增加。Western blot检测bcl-2在大鼠海马的蛋白表达进行定量分析的结果显示,Aβ组与对照组相比,大鼠海马组织BCL-2蛋白表达量明显减少（P<0.05）,葛根素组与Aβ组相比,大鼠海马组织BCL-2蛋白表达量明显增加（P<0.05）。Aβ_25³5海马注射诱导大鼠海马组织促凋亡蛋白BAX的表达增加,抗凋亡蛋白BCL-2表达减少,葛根素治疗抑制Aβ诱导的大鼠海马组织BAX的表达增加,且增加抗凋亡蛋白BCL-2表达量。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（cysteinylaspartate specific protease-3,caspase-3）是执行细胞凋亡的最重要的蛋白酶之一。用免疫组织化学染色和Western blot分析两种方法检测海马组织casepase-3蛋白的表达变化。免疫组织化学染色显示,casepase-3蛋白在神经元胞浆表达。对照组casepase-3免疫反应阳性神经元少见,着色浅,Aβ组casepase-3免疫反应阳性神经元多且着色深,葛根素组介于二者之间。Western blot分析显示,对照组大鼠海马组织casepase-3蛋白表达量低,Aβ组比对照组海马组织casepase-3蛋白表达量明显增加（P<0.05）,而葛根素组比Aβ组casepase-3蛋白表达量明显减少（P<0.05）。这提示,Aβ_25³5海马注射诱导大鼠海马神经元中凋亡相关酶casepase-3的表达增加,这是神经元凋亡过程增加的一个标志;葛根素治疗抑制Aβ诱导的大鼠海马组织casepase-3的过量表达,这可能是葛根素抑制神经元凋亡的分子机制。结论:1用Aβ_25³5双侧海马注射法成功复制大鼠AD模型,并从行为、形态学上提供海马神经元损伤的证据。2海马注射Aβ_25³5可通过诱导NF-κB信号通路激活和致炎基因COX-2和iNOS的过量表达,导致海马的炎性反应。3 Aβ_25³5海马注射可通过诱导大鼠海马促凋亡蛋白Bax表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达,并增加凋亡相关酶casepase-3的表达,从而促进大鼠海马神经元凋亡。4给予大剂量的葛根素可改善由Aβ_25³5海马注射诱导的大鼠学习记忆障碍。形态学分析证实,葛根素可阻止Aβ诱导的海马锥体细胞带神经元丢失,减轻海马神经元的损伤,维持神经元的正常超微结构。5葛根素可通过抑制Aβ诱导的NF-κB信号通路的激活,和致炎基因COX-2和iNOS的过量表达,从而抑制大鼠海马的炎性反应,减少神经元丢失和损伤,改善Aβ诱导的大鼠学习记忆障碍。6葛根素可通过抑制Aβ诱导的促凋亡蛋白Bax的表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,且抑制凋亡相关酶casepase-3的表达,从而抑制大鼠海马神经元的凋亡,保护神经元,这可能是葛根素改善Aβ诱导的大鼠学习记忆障碍的另一主要机制。