目的：动脉粥样硬化(AS)所致的心脑血管性疾病是当今严重危害人类生命健康的疾病之一,其发病率和死亡率均居各种疾病之首。但是,动脉粥样硬化的病因尚未完全清楚,治疗效果还不十分满意,因此探讨动脉粥样硬化的发生机制和寻找更加有效的治疗方法具有十分重要的意义。本课题拟通过重组腺相关病毒(rAAV)同时介导人载脂蛋白AI与人B族Ⅰ型清道夫受体双基因对大鼠动脉粥样硬化模型鼠治疗作用的研究,对比双基因联合后的治疗效果及是否优越于单独一个基因。方法和结果：1.获取携带apoAI与SR-BI双基因的重组腺相关病毒载体。本研究首先从正常流产胎儿(经产妇本人及家属同意)肝脏组织中提取总RNA,通过逆转录获得全长cDNA,然后根据序列设计特异性引物从胎肝cDNA中扩增出约804bp的apoAI序列与约1530bp的SR-BI序列,同时以pAAV2-IRES-hrGFP质粒为模板,通过特异性引物扩增出670bp的IRES序列。通过预先设计的酶切位点,将apoA工连入pAAV2-IRES-hrGFP的多克隆位点,将IRES-SR-BI序列融合后替换掉质粒载体pAAV2-apoAI-IRES-hrGFP的IRES-hrGFP序列,构建出重组腺相关病毒载体pAAV2-apoAI-IRES-SR-BI.然后采用磷酸钙共沉淀法将三质粒pAAV2-apoAI/SR-BI,pAAV2-RC,pHelper共转染HEK293细胞,包装同时含有人apoAI/SR-BI双基因的rAAV2-apoAI/SR-BI,并以pAAV2-apoAI-IRES-hrGFP质粒作为荧光对照,通过“硫酸肝素法”纯化获得rAAV2-apoAI/SR-BI与rAAV2-apoAI/IRES-hrGFP,经western-blotting和dot-blot斑点杂交检测,结果获得了较高纯度的rAAV2-apoAI/SR—BI与rAAV2-apoAI-IRES-hrGFP,两者的滴度分别为：1.2376×1011v.g/ml与6.716×1010v.g/ml。2. rAAV2-apoAI-IRES-SR-BI在HepG2 cells中的表达及对胆固醇逆向转运功能的影响。将包装纯化后的rAAV2-apoAI-IRES-GFP以不同的物理滴度体外转染HepG2 cells并于72小时后进行荧光观察,以检测病毒的活力及确定其转染效率,探索最佳转染体系。结果显示：rAAV2-apoAI-IRES-hrGFP的转染效率随病毒滴度的增高而增加,约在100MOI时达到了平台期,即获得了较好的转染效率.然而在预实验中发现50MOI与100MOI的转染效率相差并不明显,为了节约病毒用量,即分别将rAAV2-IRES-hrGFP, rAAV2-apoAI-IRES-hrGFP, rAAV2-apoAI/SR-BI三种病毒载体分别以50MOI的滴度对HepG2细胞进行转染,并设立未转染的空白对照组,于72小时内进行连续荧光观察,确定转染成功且效率达到预期标准后立即进行细胞总RNA及总蛋白提取并以β-actin为内参应用RT-PCR和western-blotting技术对转染后目的基因的mRNA和蛋白水平的表达进行半定量研究。结果显示：apoAI mRNA和蛋白质水平在rAAV2-apoAI, rAAV2-apoAI/SR-BI均得到了上调表达,SR-BI mRNA和蛋白质水平在rAAV2-apoAI/SR-BI组得到了表达。与上述体系相同,HepG2细胞于病毒转染48h后,移去上清,并加入含有ox-LDL(50μg/ml)的无血清DMEM进行共孵育培养,培养24小时后移除细胞上清液,用PBS轻轻冲洗一遍后,利用细胞裂解液收集细胞。采用HPLC胆固醇酶结合法检测各组细胞内胆固醇的含量。HPLC检测处理后各组胞内胆固醇含量可知：与其他各组相比,经过rAAV2-apoAI,rAAV2-apoAI/SR-BI处理后的HepG2细胞胞内总胆固醇含量是降低的,其中rAAV2-apoAI/SR-BI病毒转染组胞内胆固醇含量较rAAV2-apoAI-IRES-hrGFP更低；与rAAV2-GFP组和空白对照组相比,CE/TC的比值在rAAV2-apoAI组和rAAV2-apoAI/SR-BI转染组中较高。3.动脉硬化大鼠动物模型的建立,并在随机分组后分别尾静脉注射rAAV2-GFP,rAAV2-apoAI,rAAV2-apoAI/SR-BI观察其对动脉粥样硬化大鼠的治疗作用。将32只雄性大白鼠随机分为四组每组8只,其中一组为正常饮食组,另外3组为高脂饮食组,建模前测量血脂一次,并于高脂饮食3个月后分别进行血脂和B超检测,观察模型建立是否成功。取对照组大鼠和高脂组大鼠进行主动脉超声检测观察血管内膜的改变及是否出现动脉粥样硬化斑块。结果显示,对照组主动脉内膜光滑,管壁无隆起、增厚、无斑块形成,与中膜层分界清楚。所有的动脉硬化鼠均可见不同程度的动脉硬化超声改变,分别为：主动脉管壁中膜偏心性增厚,内膜不光滑,连续性中断,可见较小斑块形成,内中膜与血管外膜及周围的结缔组织分界不清。各组在动脉硬化模型建立后(3个月)血清TC与LDL-C的测定。高脂饮食后3个月与同时期正常饮食组)相比*p<0.01。确定动脉粥样硬化模型建立成功后,根据体重将模型鼠再次进行随机分组,分为三组后,分别将rAAV2-IRES-hrGFP, rAAV2-apoAI-IRES-hrGFP,rAAV2-apoAI-IRES-SR-BI三种病毒载体以1×1010v.g./ml PBS的量进行模型鼠的尾静脉注射,正常饮食组作为正常对照组尾静脉注射1 m1 PBS,为了更好的模拟临床用药特点,各组于病毒注射后均做了一定的改善饮食的处理,并于治疗后2个月检测目的基因在模型鼠体内的表达,其中两个目的基因的检测引物与载体构建时引物相同。采用与ELASA和Western-Blotting检测目的蛋白的表达,并统计各组模型鼠的血脂与B超的检测结果,对比各治疗组的治疗效果；冰冻切片后在荧光显微镜下观察荧光蛋白GFP在肝脏与动脉管壁的表达情况；应用ELASA的方法检测各组大鼠血清中hs-CRP的含量,以预测各组大鼠发生心脑血管疾病的风险系数；应用MDA,SOD检测试剂盒检测血清中其含量,借以反应各组大鼠体内的抗氧化能力；以β-actin为内参,应用RT-PCR的方法检测各处理组动脉管壁中的NF-κBp65,IKBα,VCAM一1,ICAM-1,IL-1β,MCP-1mRNA的表达,以推测各组炎症因子的表达与NF-K B活化程度之间的关系；通过检测各处理组MMP-2和MMP一9 mRNA的表达,研究基因治疗后各组的动脉壁斑块稳定性的大小；检测各处理组动脉壁eNOS mRNA水平的表达,反应其分泌NO的能力借以反应对内皮细胞的修复和保护功能。结果表明：rAAV2-apoAI-IRES-hrGFP组及rAAV2-apoAI/SR-BI组的TC及LDL-C水平较AAV2-GFP处理组有明显下降；主动脉彩色多普勒超声可以检测到rAAV2-apoAI组及rAAV2-apoAI/SR-BI组动脉粥样硬化斑块明显减少,而后者效果更明显；冰冻切片在荧光显微镜下可以观察到在rAAV2-GFP组与rAAV2-apoAI组的主动脉管壁和肝脏上均有荧光的表达；应用RT-PCR的方法,在rAAV2-apoAI与rAAV2-apoAI/SR-BI组的肝脏与动脉管壁中都检测到目的基因的表达,采用ELASA的方法检测到rAAV2-apoAI与rAAV2-apoAI/SR-BI组的大鼠血清中有人apoAI的表达；利用western-blotting技术在rAAV2-apoAI/SR-BI组的大鼠肝脏中检测到人SR-BI目的基因的表达；应用南京建成的MDA.SOD检测试剂盒检测各组大鼠血清中其含量,结果显示基因治疗后各组氧化程度均较rAAV2-GFP处理组有明显减轻(P<0.01),且rAAV2-apoAI/SR-BI治疗组效果优于rAAV2-apoAI治疗组；同时以β-actin为内参的RT-PCR检测与动脉硬化相关基因的表达结果显示,与病理对照组相比各治疗组中NF-KBp65、ICAM-1 VCAM-1、IL-1β、MCP-1、MMP-2、MMP-9、mRNA的表达明显降低；而与之相反,1KBα, eNOS治疗后的mRNA水平表达升高.通过此次检测结果我们设想apoAI与SR-BI双基因可能是通过抑制NF-KB途径的活化来发挥抑制炎症因子表达、增加斑块的稳定性以及增加NO释放作用的,从而对动脉粥样硬化起到一定的治疗作用,当然这种设想还有待于后续实验的进一步验证。结论：本研究成功完成了同时携带有apoAI与SR-BI双基因的重组腺相关病毒载体的构建；通过HPLC胆固醇酶结合法检测胞内胆固醇含量发现目的基因在HepG2细胞中高表达可以减少胞内胆固醇的净含量,并且rAAV2-apoAI/SR-BI组作用效果强于rAAV2-apoAI组；成功建立了动脉粥样硬化的SD大鼠模型；进一步的体内实验结果研究表明rAAV2-apoAI与rAAV2-apoAI/SR-BI均对动脉粥样硬化大鼠产生了一定的治疗效果,而且rAAV2-apoAI/SR-BI的治疗效果更为明显。