研究背景和意义：外周神经损伤是临床常见损伤,外周神经缺损的修复是世界性的难题,主要是神经生长速度慢和效应器、感受器萎缩快的矛盾。如何提高神经再生的速度和质量,寻找新的修复方法是外周神经损伤迫切需要解决的瓶颈问题。目前外周神经缺损的治疗策略,是依据外周神经损伤再生的理论,通过提供一个神经纤维再生通道、营造有利于神经纤维再生微环境等,涉及神经导管及细胞因子的应用、细胞或神经移植、以及近年来兴起的组织工程化外周神经等。这些治疗方法已经在动物实验或临床上取得了可喜的效果,但由于神经生长速度较慢,效应器的退化较为严重,用于修复长距离神经缺损效果不满意。鉴于此,我们提出了“桥接神经元修复外周神经缺损”的设想,即通过神经元接力的方法,加快神经到达效应器、感受器的时间,减少效应器、感受器病变程度,提高神经损伤修复的效果。为验证此设想,本研究从临床实用出发,拟以骨髓源性神经组织定向干细胞(NTCSC)源性神经元细胞为种子细胞、以同种异体脱细胞神经支架为支架材料,构建神经元性组织工程化神经,用于修复犬坐骨神经损伤,探讨神经元性组织工程化神经修复外周神经的机制及效果,旨在为外周神经缺损的修复提供一个新的方法。第一部分NTCSC的培养、诱导分化及鉴定研究目的：研究骨髓源性神经组织定向干细胞(NTCSC)的分离、培养、鉴定及向神经元细胞的诱导分化,探讨作为神经元细胞来源种子细胞的可能性。研究方法：取beagle犬自体骨髓,全骨髓培养,留取贴壁细胞,添加BFGF和EGF的无血清培养液继续培养,待细胞聚集呈球状时,吹打散开后传代培养扩增,细胞鉴定。分别用RA+SHH和NRG1诱导分化,观察诱导细胞形态、生长情况,检测其表面标志。结果：传代细胞悬浮、球形生长、增殖能力旺盛、Nestin阳性,为骨髓源性神经组织定向干细胞。RA+SHH诱导分化后,神经球贴壁、分散、β-Tubulin阳性、NeuN阳性,为神经元样细胞。NRG1诱导后,神经球散开、长出较长的突起、表达S-100,为雪旺氏细胞。结论：NTCSC扩增能力强、有神经系细胞的特性、易于向神经元样细胞以及雪旺氏细胞分化,是较为理想的神经元细胞来源的种子细胞。第二部分神经元性组织工程化神经的的构建。研究目的：研究脱细胞支架制备、组织工程化神经的构建,制备神经元性组织工程化外周神经移植体。研究方法：取Beagle犬坐骨神经6cm,修剪、0.3%SDS脱细胞5天、RNA酶和DNA酶消化2天、蒸馏水反复漂洗5天、密封、60Co辐照灭菌、4℃保存。将诱导的雪旺氏细胞和神经元样细胞按照1：1的比例混合成细胞悬液,用微量注射器种植到支架中,制成神经元性组织工程化神经移植体。结果：大体观察见脱细胞神经支架外形完整,乳白色,H-E染色未见到细胞成分,纤维连续无断裂。组织工程化神经移植体柔软、饱满,种植细胞在支架内生长,迁移、分布均匀。结论：成功构建了神经元性组织工程化外周神经移植体。第三部分神经元性组织工程化神经的体内研究研究目的：研究神经元性组织工程化外周神经移植修复坐骨神经6cm缺损的效果,探讨桥接神经元修复外周神经长段缺损的可行性。研究方法：制备犬双坐骨神经6cm缺损模型6只,神经元性组织工程化神经、雪旺氏细胞性组织工程化神经和自体神经分别移植到相应的犬4侧缺损的坐骨神经上。术后进行动物行为学观察。术后13周,三组犬进行肌电图检测。4侧神经元性组织工程化神经移植组行辣根过氧化物酶逆行追踪；全部动物处死、取坐骨神经、切片、免疫组织化学染色、甲苯胺蓝染色、透射电镜检测；取腓肠肌、检测蛋白质的含量。结果：术后犬下肢不能活动,自术后2周始,三组犬均出现下肢肌肉萎缩、足底溃疡。术后8周,神经元性组织工程化外周神经移植犬对针刺有反应、下肢能触地行走,自体神经移植组术后10周恢复感觉运动功能,雪旺氏细胞性组织工程化神经移植组术后13周恢复感觉运动功能。肌电图检测表明：神经元性组织工程神经恢复效果理想。神经元性组织工程化外周神经移植犬腓肠肌中注射HRP后,神经移植体内可见天青色的团块。免疫组织化学显示,神经元性组织工程化神经移植体中NeuN阳性。甲苯胺蓝染色,神经元性组织工程化神经移植体中髓鞘数量多于雪旺氏细胞性组织工程化神经移植组。透射电镜显示神经元性组织工程化神经移植体中有突触的形成。考马斯亮蓝检测腓肠肌蛋白质含量,实验组>自体神经移植组>雪旺氏细胞移植组。结论：种植的干细胞源性神经元样细胞可以在外周神经微环境内存活、并维持神经元的功能,桥接神经元修复外周神经缺损的效果优于传统组织工程化神经和自体神经移植,桥接神经元修复外周神经缺损可行。