不同浓度的抑肽酶和氨甲环酸对体外纤维蛋白胶软骨细胞复合物降解速度的影响的实验研究

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目的:通过在FG中引入不同浓度的抑肽酶和氨甲环酸,探索其对FG支架的降解速率及对软骨细胞的繁殖、表型的维持、基质的分泌产生的影响及影响大小。在FG支架的降解与软骨细胞的繁殖、表型的维持、基质的分泌之间找到一最佳平衡点,为组织工程方法过渡到临床做前期工作。方法:1.取3周龄新西兰幼兔的关节软骨制取软骨细胞,体外单层培养、扩增后种植于FG支架上,构建标准FG支架细胞复合物和不同浓度的抑肽酶(5000KIU/ml、10000KIU/ml、20000KIU/ml)及氨甲环酸(10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml)的改良FG支架细胞复合物(实验分九组,浓度由低到高),进行体外三维立体培养、扩增。观察软骨细胞在FG支架上的形态变化,绘制细胞生长曲线,光镜和透射电镜下的组织形态学观察及Ⅱ型胶原免疫组化检测(S—P法),并测量不同时期FG支架细胞复合物质量和载体降解情况,对所得数据进行统计学处理。结果:1.标准组及实验1、2、4、5组镜下可见软骨细胞在空泡内分裂增殖,改良7、8组一周后可见部分细胞分裂,细胞呈梭型,类似树枝样生长,呈现反分化现象,实验9组体外培养9天细胞呈阿米巴样改变,细胞分裂相少。2.标准组及改良1、5组,透射电镜下可见基质的外分泌。3.标准组及实验1、2、4、5组一周及二周Ⅱ型胶原免疫组化检测可见空泡内软骨细胞周围均出现阳性棕色颗粒,软骨细胞在纤维蛋白胶支架中立体培养可分泌胞外基质。4.标准FG支架细胞复合物和不同浓度的抑肽酶和氨甲环酸的改良FG支架细胞复合物体外培养1周及2周时,其剩余质量之间比较P<0.001,细胞标准支架组和所有实验组支架降解速度有显著性差异。而实验1,9组之间,体外培养1周及2周后剩余质量之间比较P<0.05。实验1组与实验9组支架体外培养降解速度有显著性差异。改良FG支架细胞组在体外4周的培养过程中仅有少量崩解,标准FG支架细胞组则完全崩解。5.标准组及改良1、5组细胞倍增平均时间4.7天,改良9组为5.9天。标准组及改良1、5组三条细胞生长曲线相近,而改良9组细胞生长曲线明显偏低。结论:1.通过在纤维蛋白胶中引入不同浓度的抑肽酶和氨甲环酸,在体外环境下均可以显著地减缓纤维蛋白胶的降解速度,浓度的高低与FG支架的降解速率成反比。2.不同浓度的抑肤酶和氨甲环酸对软骨细胞的增殖有一定的影响。高浓度抑肤酶和氨甲环酸的加入明显抑制了细胞的增殖。而浓度低于10000KJU/m1的抑肤酶和20mg/ml氨甲环酸的加入对细胞增殖无不良影响3.高浓度的抑肤酶(20O00KIU/ml)影响了细胞表型的维持,使软骨细胞呈现了去分化改变。4.抑肤酶浓度为l000oKlu/ml,氨甲环酸浓度为20mg/ml时,最大限度地延缓了FG支架的降解速度,而对软骨细胞的增殖、表型的维持、基质的分泌无不良影响,为最佳平衡点。
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