人NDRG2是我校于1999年首次克隆得到的，属于NDRG（N-myc downstream regulated gene 2）家族，NDRG家族包括四个成员：NDRG1，NDRG2，NDRG3和NDRG4。大多文献报道，该家族成员可能为抑癌基因，并可能与细胞增值与分化有关，但具体功能还有待进一步研究。在正常成年人大脑中NDRG2含量较高，且在灰质的表达要高于白质。正常成年小鼠大脑各个区域均有不同程度的表达。另外在阿尔兹海默病人的大脑中NDRG2的表达升高。因此NDRG2与中枢神经系统及疾病关系较为密切。脑中风被认为是世界上世界上致死致残的主要原因之一，这个难题的攻克一直是各国医学工作者致力研究的课题。脑缺血及后续的再灌注损伤引发的一系列病理生理变化，如兴奋性中毒、酸中毒、离子失衡、梗死周围去极化、氧化应激、炎症和凋亡等，对人体造成不同程度的损害。但目前并没有治疗脑中风切实有效的方法。局灶性脑缺血可导致一个损伤较重的缺血核心区的形成及其周围损伤较轻的缺血半暗带的形成。这个缺血半暗带的存在理论上证明治疗性的补救方法是可能的。近年来，缺血半暗带更是被定义为一个多分子的半暗带，为缺血脑损伤的治疗提供了一个新颖的研究前景。研究发现脑缺血过程中的血流减少和低氧可以激活一些潜在的损伤性分子和保护性分子的表达。因此在研究这些分子的过程中，将逐步寻找治疗脑中风的靶点。本实验室研究人员已经证明，在低氧的条件下NDRG2表达显著上调，且与低氧诱导的凋亡密切相关。因此我们假设，在局灶性脑缺血后，在大脑低氧状态下，NDRG2的表达是不是也会升高，且其升高也涉及凋亡相关分子，参与了凋亡相关作用。先前我们实验室证明了NDRG2表达在大脑不同的区域，如大脑皮质、臭球、中脑、海马和丘脑，其中在中脑和丘脑的水平较高。文献也证明NDRG2定位于星形胶质细胞而非神经元细胞。在目前我们的研究中，分别探讨了NDRG2大鼠脑缺血再灌注损伤后的作用及离体培养的C6细胞经氧糖剥夺（Oxygen and glucose deprivation，OGD）处理后的表达及凋亡相关机制研究。具体实验计划及结果如下：　　第一部分:NDRG2在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后的表达及其功能　　目的：研究大鼠局灶性脑缺血后NDRG2的表达及其功能　　方法：雄性SD大鼠，采用大脑中动脉闭塞术构建大鼠局灶性脑缺血模型，按随机数字法分组。给与120min缺血，并于再灌注4h、12h、24h和72h后处死。此外，设立假手术Sham组，除不插入栓线外，其余处理都同MCAO组相同。动物处死后，做TTC染色确定缺血半暗区，用免疫组化法定性检测NDRG2蛋白的分布，Western-blot定量测NDRG2蛋白表达，RT-PCR半定量测NDRG2mRNA表达，NDRG2和GFAP免疫荧光双标法测NDRG2的细胞定位。细胞凋亡用TUNEL法检测。　　结果：缺血再灌24小时后，NDRG2主要表达于缺血半影区的类星形胶质细胞中，且NDRG2蛋白表达在再灌4小时开始增加，再灌24小时达到高峰，再灌72小时与假手术相比无统计学意义。NDRG2mRNA的表达和蛋白表达趋势一致。免疫荧光双标显示，NDRG2定位于GFAP标记的星形胶质细胞，在假手术组主要定位于星形胶质细胞的胞浆，而缺血再灌24小时候则主要定位于DAPI标记的胞核。TUNEL染色结果显示，缺血再灌后凋亡细胞增加，且通过TUNEL和NDRG2双标检测显示：NDRG2信号与TUNEL阳性细胞存在共定位。　　结论：本实验室首次证明局灶性脑缺血后缺血半暗区NDRG2的表达上调。NDRG2在缺血再灌后定位于半暗区的星形胶质细胞中。局灶性脑缺血后NDRG2的表达从星形胶质细胞的胞浆转移到胞核。NDRG2可能涉及中风后的细胞凋亡。　　第二部分:NDRG2在C6细胞OGD后的表达及其在细胞凋亡中的作用　　实验一：IL-6诱导C6细胞分化　　目的：将C6细胞由IL-6诱导分化为星形胶质细胞　　方法：常规培养C6胶质瘤细胞，参考成熟的文献，将C6细胞接种于6孔板中，细胞生长密度达1×106个/孔后，给予IL-6诱导分化24小时，倒置显微镜观察细胞形态并拍照，提取细胞蛋白，Western-blot测诱导前后GFAP蛋白的表达，定量的检测分化状态。　　结果：IL-6诱导分化24小时后，显微镜下显示C6细胞由正常的扁平多极样的形态转变为诱导分化后的具有两极突起的纺锤体形态，细胞出现更多更长的细丝状类轴突状突起，分化为类星形胶质细胞形态。Western-blot结果显示与正常C6细胞相比，IL-6诱导分化后的细胞中GFAP的表达明显升高。　　结论：我们通过IL-6诱导C6细胞分化为星形胶质细胞，从而模拟大体的星形胶质细胞，有助于进一步的研究。　　实验二：NDRG2在C6细胞OGD后的表达　　目的:研究NDRG2在C6细胞OGD后的表达变化及细胞定位　　方法：诱导分化后的C6细胞，构建OGD模型来模拟中风。细胞在OGD4h并再氧合2h、12h和24h后终止培养。并设立正常对照组，除不施行OGD，余同。Western-blot检测各组细胞NDRG2蛋白表达。RT-PCR法测各组细胞NDRG2的mRNA表达。GFAP和NDRG2免疫荧光双标法检测各组细胞的定位情况。将细胞胞浆和胞核分别提取蛋白后，Western-blot分别测各组NDRG2的蛋白表达。　　结果：Western-blot结果显示，与正常未受处理的C6细胞相比，OGD与再氧合后2小时后，NDRG2的蛋白水平开始增加，到再氧合后24小时，达到高峰。与Western-blot结果一致的是，RT-PCR结果也显示OGD与再氧合后2小时后，NDRG2的mRNA水平开始增加，到再氧合后24小时，达到高峰。差异具有统计学意义。免疫细胞化学揭示，在正常IL-6诱导的C6细胞中，NDRG2与GFAP存在共定位，揭示其主要表达在胞质，而与DAPI的核染未发生共定位。而在OGD和再氧合后的细胞中，NDRG2不仅与GFAP共定位，更与DAPI的核染具有强烈的共定位。为了进一步证实，分离提取胞质和胞核后的Western-blot结果也与此结果一致，证明NDRG2在OGD后的C6细胞中发生了核转位。　　结论：我们首次证实OGD后，C6细胞中NDRG2的表达显著上调，并随再氧合时间增加而增加。OGD后NDRG2由细胞质转移到核内发挥作用，提示NDRG2可能参与细胞核内某些功能。　　实验三：NDRG2在OGD后C6细胞凋亡中的作用和机制　　目的：研究NDRG2与OGD后C6细胞凋亡发生的关系及相关机制　　方法：首先构建大鼠NDRG2过表达pEGFP-C1载体以及NDRG2siRNA载体。接着用脂质体Lipofectamine 2000分别将NDRG2过表达pEGFP-C1载体和空载体Vector、NDRG2siRNA载体和阴性对照Control转染C6细胞，转染24小时后，荧光显微镜观察细胞转染情况，Western-blot测NDRG2表达来鉴定转染效率。转染结束后用MTT法测细胞活力。TUNEL法测C6细胞OGD后的凋亡情况。接着在转染24小时后给予各组细胞OGD4h及再氧合24h，Western-blot测凋亡相关分子BAX、BCL-2的表达。　　结果：通过测序及Western-blot鉴定，构建载体成功。且在成功转染细胞后，MTT结果显示转染NDRG2siRNA载体，可促进细胞生长，而转染NDRG2过表达pEGFP-C1载体后，对细胞生长存在抑制作用。TUNEL结果显示，OGD后C6细胞发生了明显的凋亡。Western-blot测BAX和Bcl-2结果显示，转染NDRG2siRNA载体后，BAX的表达降低，而转染NDRG2过表达pEGFP-C1载体后，BAX的表达升高，二者Bcl-2的蛋白表达均未发生变化。　　结论：NDRG2过表达可抑制细胞生长，而干涉NDRG2表达后，可促进细胞生长；NDRG2过表达后，抗凋亡因子BAX水平上调，促凋亡因子Bcl-2水平未发生变化，BAX/Bcl-2比值上调；而NDRG2被干涉后，抗凋亡因子BAX水平下调，促凋亡因子Bcl-2水平也未发生变化，BAX/Bcl-2比值下调，揭示NDRG2可能参与了促凋亡作用。　　总之，本实验首次证明NDRG2在大鼠脑缺血再灌注损伤后发生显著上调，且主要定位于星形胶质细胞。我们也首次证明NDRG2在再灌注损伤的星形胶质细胞内发生了核转位。且在再灌注损伤后的凋亡阳性细胞中也发现了NDRG2的表达，揭示了NDRG2可能参与了再灌注损伤后的凋亡过程。接着我们进一步通过离体试验，首次证明NDRG2在C6细胞OGD后显著上调，也发生了明显的核转位。将NDRG2过表达或干涉后，进一步证明NDRG2通过上调凋亡相关因子BAX/Bcl-2，参与了促凋亡相关通路，因而进一步揭示了NDRG2在脑缺血再灌注后转移到核内，在凋亡发生中发挥重要的作用。