【研究背景及目的】我国是慢性肝病发病率较高的国家之一。尽管在过去数十年,随着乙肝疫苗的普及推广、抗病毒治疗的进展以及医疗卫生条件的改善,病毒性肝炎的感染率有所下降,但肝炎造成死亡的人数却呈增加趋势,其中大部分病毒性肝炎的死亡原因是慢性肝病,尤其是肝硬化。目前我国仍然面临肝病这一公共卫生问题的重大挑战,因此,深入研究肝纤维化肝硬化的发病机制,为其基础研究和临床治疗提供新的思路和手段至关重要。肝纤维化的本质是肝脏对慢性损伤的修复反应,其形成机制十分复杂,涉及多种细胞参与,包括受损肝细胞、肝脏非实质细胞、募集的免疫细胞,以及细胞自分泌和旁分泌构成的复杂的细胞因子网络和信号通路。肝纤维化如未在疾病早期加以干预,肝脏反复损伤后的修复反应可导致细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积、瘢痕形成,最终进展为肝硬化甚至肝癌。研究已证实,肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）活化在肝纤维化的发生发展中占据中心地位,持续活化的HSCs通过增殖、趋化、收缩及胶原合成,并募集更多炎症细胞至损伤部位,放大炎症反应,进一步造成肝脏损伤、肝脏功能异常、肝内结构重建、产生纤维样病变。HSCs活化的起始和持续,则直接受肝脏巨噬细胞的调节。肝脏作为机体重要的免疫器官之一,含有丰富的细胞成分,众多非实质细胞包括巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞等,通过产生并分泌细胞因子,发挥免疫防御、免疫调节作用。其固有免疫通过调节抗炎和促炎细胞因子间的平衡,在宿主防御微生物入侵、肝损伤及修复方面,发挥着重要作用。其中,肝脏巨噬细胞在复杂的肝脏免疫微环境中,扮演着维持肝脏稳态的重要角色,也是肝纤维化发生发展的“燃料”或“制动器”。肝脏巨噬细胞之所以在肝纤维化中处于关键地位,由其高度异质性的生物学特性所决定。肝脏巨噬细胞根据其来源,分为肝脏固有巨噬细胞,即枯否细胞（Kupffer cells,KCs）,和由外周单核细胞募集至肝脏的单核源性巨噬细胞。在不同的肝脏微环境中,不同表型的巨噬细胞发挥不同的功能作用,亦可相互转化,从而对肝纤维化的发生、发展和逆转中起双重调控作用。肝脏固有巨噬细胞根据其表型和功能,主要分为促炎促纤维化的M1型及抗炎促进修复的M2型,前者主要发挥宿主抗微生物的免疫防御功能,同时可引起组织的炎症反应,加重损伤,M2型巨噬细胞则在炎症反应后期发挥抗炎作用,促进组织修复和重塑,具有一定抗纤维化作用。肝脏巨噬细胞另一重要组成部分则由循环中的单核细胞分化而来,对小鼠模型的研究揭示了两个主要表型:Ly6C^hi和Ly6C^lo单核细胞。募集至肝脏的单核巨噬细胞在趋化因子CX3CL1（Chemokine（C-X3-C motif）ligand 1）作用下可在肝脏特定的微环境中分化为Ly6C^lo表型巨噬细胞,该亚群的巨噬细胞可分泌降解细胞外基质的基质金属蛋白酶类（matrix metalloproteinases,MMPs）,从而促进肝纤维化逆转。深入研究单核巨噬细胞亚型功能及相关分子机制,有助于我们对慢性肝损伤和纤维化的发病机制更全面的理解,从而为肝纤维化治疗提供新的方向。纤维介素蛋白2（fibrinogen-like protein 2,Fgl2）,分为膜型和分泌型,属于纤维蛋白原相关蛋白超家族。研究观察到,在与炎症相关疾病如爆发性肝炎、重型乙型肝炎及同种异体排斥反应中,Fgl2显著上调,同时促进疾病进展。Fgl2在巨噬细胞、内皮细胞、树突状细胞和T细胞中均有表达,且在巨噬细胞中表达最高。既往研究发现,在慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）患者中,上调的Fgl2与肺泡巨噬细胞的活化相关,敲降Fgl2则减轻了巨噬细胞的活化,提示Fgl2在巨噬细胞极化中潜在的促进作用。然而,关于Fgl2在肝纤维化病程中的作用及机制目前尚无研究报道。本研究拟在临床确诊的乙肝肝纤维化患者及肝纤维化小鼠模型肝组织中,观察Fgl2表达变化,确定其与肝纤维化进展的关系,进一步鉴定Fgl2的主要细胞来源。在此基础之上,结合体内外实验探讨Fgl2对肝纤维化进程、肝脏巨噬细胞极化功能的调节及对肝星状细胞活化的影响,旨在阐明肝纤维化的分子机制,为肝纤维化的治疗提供新的思路。【研究方法】1.应用Realtime-PCR对临床慢乙肝肝纤维化患者肝穿组织FGL2、COL1A1 mRNA表达进行检测,研究不同级别肝纤维化FGL2的表达差异,并分析肝组织FGL2与COL1A1的相关性。2.利用四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl₄）诱导建立肝纤维化小鼠模型,Realtime-PCR和Western blot检测肝组织Fgl2基因和蛋白水平表达,验证其在肝纤维化进程中的表达。3.应用HE染色、天狼星红（Sirius Red）染色、免疫组织化学、免疫荧光双染,检测Fgl2在肝纤维化小鼠模型中肝组织的表达和定位。4.应用肝脏原位灌流消化、密度梯度离心及磁珠分选技术,分离纯化原代肝脏巨噬细胞及肝窦内皮细胞,进一步利用Realtime-PCR检测Fgl2在两种细胞中的表达,对其定量分析。5.在野生型小鼠和Fgl2^-/-小鼠中,建立CCl₄和硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）两种不同发病机制的肝纤维化模型,并在CCl₄模型中设置自然恢复组,研究Fgl2在肝纤维化进展及逆转中的作用;应用化学发光免疫分析、HE染色、Sirius Red染色,检测野生型和Fgl2^-/-小鼠血清ALT、AST水平及肝组织炎症和胶原沉积。6.应用Realtime-PCR检测野生型和Fgl2^-/-小鼠肝组织纤维化相关基因Col1a1、α-Sma、Tgfb1及基质金属蛋白酶类Mmp2、Mmp9、Mmp13转录水平的表达。7.应用免疫组织化学法检测野生型和Fgl2^-/-小鼠肝脏F4/80表达,利用图像分析软件对其进行定量。8.应用ELISA检测与巨噬细胞活化相关细胞因子Tnfα、Il-1β、Il-6及趋化因子Ccl2的表达。9.应用流式细胞术检测并比较野生型和Fgl2^-/-小鼠肝纤维化期及恢复期,肝脏固有巨噬细胞(F4/80^hiCD11b^int)和单核源性巨噬细胞(CD11b^hiF4/80^int)的比例及绝对数量,并进一步分析M1、M2型固有巨噬细胞及Ly6C^hi、Ly6C^lo单核源性巨噬细胞比例及绝对数量。10.通过尾静脉注射胞壁酰二肽（muramyl dipeptide,MDP）,应用流式细胞术检测给药72h后野生型和Fgl2^-/-小鼠外周血单核细胞亚型变化。11.建立CCl₄诱导的肝纤维化模型,造模3周时尾静脉注射MDP,应用流式细胞术检测野生型和Fgl2^-/-小鼠外周血单核细胞亚型、肝脏巨噬细胞亚型,应用Sirius Red染色,评估对肝纤维化的干预作用。12.分离并诱导骨髓源性巨噬细胞,利用不同细胞因子刺激定向极化M1型及M2型巨噬细胞,运用Realtime-PCR检测细胞因子谱的基因表达。13.应用肝脏原位灌流消化、密度梯度离心及磁珠分选技术,分离纯化原代HSCs,体外培养3d及7d,分别鉴定未活化及活化的肝星状细胞。14.应用Transwell,将极化诱导的M1型巨噬细胞与未活化的原代HSCs共培养,鬼笔环肽（phalloidin）荧光染色鉴定HSCs形态,Realtime-PCR检测HSCsα-Sma、Col1a1的表达。【结果】1.Fgl2在慢乙肝肝纤维化患者和小鼠肝纤维化模型肝组织中表达升高与慢乙肝肝纤维化分期为S2-S3的患者相比,S4-S6患者肝脏FGL2表达水平显著升高,且与肝脏COL1A1合成水平呈正相关。患者经恩替卡韦联合扶正化瘀有效治疗60周,二次肝穿显示肝纤维化评分下降≥1的患者,其肝脏FGL2表达水平也显著下调。成功建立CCl₄诱导的肝纤维化小鼠模型,与临床样本结果一致,肝组织Fgl2转录及蛋白表达水平均显著高于对照组。提示Fgl2可能参与调控肝纤维化进程。2.肝纤维化中肝脏巨噬细胞是表达Fgl2的主要来源肝组织免疫荧光双染提示,Fgl2主要表达在肝脏巨噬细胞。经肝脏原位灌流、磁珠分选提取肝脏肝脏巨噬细胞和肝窦内皮细胞,定量结果显示巨噬细胞中Fgl2基因水平显著高于内皮细胞。3.Fgl2缺失具有延缓肝纤维化进展及促进其逆转的作用于野生型小鼠和Fgl2^-/-小鼠中成功建立CCl₄和TAA诱导的肝纤维化小鼠模型。在肝纤维化期,血清ALT和AST、肝组织炎症损伤、胶原沉积、羟脯氨酸水平在Fgl2^-/-小鼠中均显著低于野生型小鼠。肝纤维化相关因子（Col1a1、α-Sma、Tgfb1）及基质金属蛋白酶Mmp2 mRNA均显著下调,而Mmp9、Mmp13显著升高。损伤停止后,肝纤维化恢复期,Fgl2^-/-小鼠中亦观察到明显的炎症减轻和纤维降解。提示Fgl2分子具有促进肝纤维化进展的作用。4.Fgl2缺失抑制肝脏巨噬细胞活化免疫组织化学染色结果示,Fgl2^-/-小鼠肝组织巨噬细胞数量明显减少。肝组织匀浆ELISA提示:与巨噬细胞活化相关的促炎因子Tnfα、Il-1β、Il-6及趋化因子Ccl2的表达,与对照组比较,Fgl2^-/-小鼠在肝纤维化及恢复期均显著降低。5.Fgl2缺失促进肝脏巨噬细胞向抗纤维化表型分化肝纤维化期及恢复期,Fgl2^-/-组肝脏原位巨噬细胞亚型,包括固有巨噬细(F4/80^hii CD11b^int)和单核源性巨噬细胞(CD11b^hiF4/80^int)的比例及绝对数量均显著下调。进一步分析,在Fgl2^-/-小鼠中,促纤维化巨噬细胞包括M1极化的KCs和Ly6C^hi单核巨噬细胞,其比例及数量均显著减少,而与修复功能相关的巨噬细胞包括M2极化的KCs和Ly6C^lo的巨噬细胞显著增加。6.MDP给药促进Fgl2对外周血单核细胞及肝脏巨噬细胞分化的调节作用MDP可诱导正常Fgl2^-/-小鼠外周单核细胞Ly6C^hi向Ly6C^lo更快速的转化。将MDP给药肝纤维化小鼠,Fgl2^-/-组外周血循环Ly6C^hi和Ly6C^lo单核细胞数量显著增加,但肝脏Ly6C^hi明显减少,Ly6C^lo巨噬细胞显著增加,并伴有肝组织纤维沉积减少。7.Fgl2直接调控巨噬细胞极化Fgl2^-/-的M1型巨噬细胞特异性炎症因子（Tnfα、Nos2、Il-6、Il-1β、Ccl2）mRNA表达均显著下调;而Fgl2^-/-的M2型巨噬细胞其炎症因子（Il-10、Tgfb1、Arg-1、Ym-1、Fizz 1）mRNA表达均显著升高。8.Fgl2缺失抑制M1型巨噬细胞极化从而减弱对HSCs的活化作用Fgl2^-/-的M1型巨噬细胞与HSCs体外共培养,phalloidin染色HSCs细胞骨架及其活化标志α-Sma、Col1a1 mRNA水平,均显示HSCs活化低于WT组。【结论】1.本研究发现,Fgl2在临床及小鼠肝纤维化肝脏中表达升高,且肝脏巨噬细胞是肝纤维化病程中表达Fgl2的主要来源。2.Fgl2在肝纤维化进展过程中,通过直接调控巨噬细胞极化,促进巨噬细胞向促纤维化表型转换,诱导肝纤维化进展和加重。3.Fgl2通过直接调控巨噬细胞向M1型极化,从而促进肝星状细胞活化。