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目的TRPCs广泛分布于各种内皮细胞膜上,而且被明确证实参与许多组织血管内膜损伤后新生血管发生,但在人糖尿病视网膜血管病变发生发展过程是否起到调节作用目前鲜有报道。我们前期实验证实TRPC1、TRPC6在基因水平参与人视网膜血管内皮细胞株的增殖迁移及管腔形成,机制与调节VEGF表达相关,本实验将从蛋白水平验证TRPC1、TRPC3、TRPC6在人视网膜血管内皮细胞株中的作用及与VEGF表达的关系。材料与方法1.将HREC分为三组,分别加入含5.5mM葡萄糖、30mM葡萄糖以及24.5mM甘露醇+5.5mM葡萄糖培养基,干预24、48小时后提取细胞总蛋白,检测高糖对TRPC不同亚型(TRPC1、TRPC3、TRPC6)的蛋白表达影响;2.将HREC分为5组(30mM葡萄糖、30mM葡萄糖+2mg/LSKF96365、30mM葡萄糖+4mg/LSKF96365、30mM葡萄糖+8mg/L SKF96365、30mM葡萄糖+16mg/L SKF96365,注:SKF96365是TRPC通道阻滞剂),干预24、48小时后提取细胞总蛋白,检测TRPC通道抑制剂对高糖诱导的细胞VEGF的蛋白表达影响;3.将HREC分为三组,饥饿处理24小时,后分别加入含5.5mM葡萄糖、30mM葡萄糖以及24.5mM甘露醇的正常培养基,将细胞转移到放置载玻片的12孔板内,设置4个复孔,培养24小时待细胞贴壁,取出载玻片进行细胞爬片免疫组化,观察在高糖影响下TRPC1、TRPC3、TRPC6的定量和定位表达,通过倒置相差显微镜拍摄记录;4.将HREC分为5组,饥饿处理24小时后加入30mM葡萄糖、30mM葡萄糖+2mg/LSKF96365、30mM葡萄糖+4mg/LSKF96365、30mM葡萄糖+8mg/L SKF96365、30mM葡萄糖+16mg/L SKF96365,将细胞加入放置载玻片的24孔板内,设置4个复孔,待细胞贴壁,加入不同浓度的TRPC干预剂SKF96365高糖培养基干预24 h后,取出载玻片进行细胞爬片免疫组化,观察在TRPC通道抑制剂作用下细胞VEGF的定量和定位表达,通过倒置相差显微镜拍摄记录;结果1.Western blot结果显示,高糖诱导人视网膜血管内皮细胞株24、48小时后TRPC1在蛋白水平表达增高(P<0.05),时间依赖性不明确,高渗组TRPC1蛋白表达差异无统计学意义,TRPC3、TRPC6蛋白水平表达差异无统计学意义(P>0.05);2.Western blot结果显示,高糖诱导人视网膜血管内皮在不同浓度TRPC通道抑制剂SKF96365干预24、48小时后,4、8、16mg/L SKF96365干预组抑制细胞VEGF表达降低,呈浓度和时间依赖性(P<0.05);3.细胞爬片免疫组化(IHC)结果显示,高糖诱导人视网膜血管内皮细胞株24小时后TRPC1在蛋白水平表达增高(P<0.05),高渗组TRPC1蛋白表达差异无统计学意义;可以看到TRPC1在细胞的定位主要是在细胞膜与细胞质。TRPC3、TRPC6蛋白水平表达差异无统计学意义(P>0.05);4.细胞爬片免疫组化(IHC)结果显示,高糖诱导人视网膜血管内皮在不同浓度TRPC通道抑制剂SKF96365干预24小时后,2 mg/L、4 mg/L、8mg/L、16mg/L SKF96365干预组细胞VEGF表达显著下调(P<0.05),呈浓度依赖性。可以看到VEGF在细胞的定位主要是在细胞膜与核周。结论1.高糖可诱导人视网膜血管内皮细胞株的TRPC1蛋白表达增高;2.阻断TRPC通路抑制高糖诱导人视网膜血管内皮细胞株上调VEGF的表达量。