研究背景和目的　　 Reg基因(Regenereting gene,Reg)由RegⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4个成员组成1个基因家族。该家族属于血凝素类分泌蛋白,功能相当于抗凋亡因子、急性反应蛋白和神经细胞生长因子。人类RegⅠ基因是1个单拷贝基因,定位于2号染色体,由6个外显子和5个内含子组成。国外近年的研究表明,RegⅠ(regeneratinggeneⅠ)蛋白在胃癌组织中高表达； RegⅠ基因的表达与胃癌的分化程度、浸润性生长以及患者的预后均存在有相关性。胃癌细胞中,胃泌素可刺激RegⅠ基因的表达；高胃泌素血症病人的胃组织RegⅠ基因高表达。RegⅠ基因可能是胃泌素促进胃癌发生过程中的下游基因。　　 胃泌素是一种由胃肠道G细胞分泌的多肽类激素。能与胃泌素受体特异结合,具有营养胃粘膜及刺激胃酸分泌的作用。胃泌素对大多数正常及恶性变的胃黏膜及肠道黏膜均表现出很强的增殖效应,而且在胃黏膜的恶性变过程中起着非常重要的作用。胃泌素对培养的胃癌细胞并无直接的生长刺激作用,而是通过刺激Reg蛋白的表达来刺激细胞的生长。胃泌素表达抑制后,胃癌细胞的生长明显受到抑制。但是,胃泌素促进胃癌细胞增殖的机制尚不清楚。　　 真核细胞的基因表达调控由顺式作用元件(cis-acting element)和反式作用因子(trans-acting factor)相互作用实现。目前在真核生物的基因中,发现了很多基因的内含子均能够提高其转录效率。PegⅠ基因内含子是否具有顺式调控功能?本研究分别克隆人白细胞、胃癌细胞BGC-823和SGC-7901细胞RegⅠ基因第2内含子,构建荧光素酶报告载体。转染胃癌细胞并经G418筛选后,检测荧光素酶活性,分析RegⅠ基因第2内含子的顺式调控功能。胃泌素孵育含有荧光素酶报告载体的且稳定转染的胃癌细胞系,观察胃泌素对RegⅠ基因第2内含子的顺式调控功能的效应。　　 材料与方法　　 1.构建RegⅠ基因第2内含子萤光素酶报告载体应用PCR技术分别从人白细胞、胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901克隆RegⅠ基因第2内含子,产物经XhoⅠ和HindⅢ双酶切后,将RegⅠ基因第2内含子片段克隆入T载体,分别命名为pTR-Human-introm2、pTR-BGC-823-intron2和pTR-SGC-7901-intron2。再亚克隆至萤光素酶报告载体pGLA,构建含RegⅠ基因第2内含子的报告载体,分别命名为pGL4-Human-intron2、pGL4-BGC-823-intron2和pGL4-SGC-7901-intron2。重组质粒经XhoⅠ/HindⅢ双酶切、PCR及测序鉴定。　　 2.转染及筛选BGC-823细胞:对照组,BGC-823细胞,无质粒转染；实验对照组,转染pGL4；实验组,分别转染pGL4-Human-intron2和pGL4-BGC-823-intron2。SGC-7901细胞:对照组,SGC-7901细胞,无质粒转染；实验对照组,转染pGL4空质粒；实验组,分别转染pGL4-Human-intron2质粒和pGL4-SGC-7901-intron2。应用脂质体LipofectaminenTM2000转染,G418筛选。　　 3.荧光素酶活性检测加入1×10-6mol/L胃泌素孵育12 h,提取细胞上清,Glomax荧光检测仪检测各组细胞胃泌素孵育前后荧光素酶活性。　　 4.RegⅠ基因第2内含子的转录因子结合位点分析应用rVISTA在线分析软件分析PegⅠ基因第2内含子的转录因子结合位点。　　 5.统计学分析:实验数据均采用SPSS13.0统计软件进行结果分析。数值以均数±标准差表示,应用单因素方差分析进行组间数值差异比较,以P<0.05为差异有显著性。　　 结果：　　 1.构建RegⅠ基因第2内含子萤光素酶报告载体pGL4-Human-intron2、pGL4-BGC-823-intron2和pGL4-SGC-7901-intron2经PCR扩增及双酶切鉴定,证明插入片段正确。DNA测序鉴定,结果与GenBank报道的一致,且插入方向正确。　　 2.转染及筛选G418筛选后得到稳定转染的pGL4-Human-intron2、pGL4-BGC-823-intron2和pGL4-SGC-7901-intron2胃癌细胞系。　　 3.荧光素酶活性检测:BGC-823细胞pGL4-Human-intron2组、pGL4-BGC-823-intron2组和pGL4组荧光素酶活性分别为203529±19653.7、14534.71159.3和236±11.2,实验组明显高于实验对照组(P<0.05)；SG-C-7901细胞pCL4-Human-intron2组、pGL4-SGC7901-intron2组和pGL4组荧光素酶活性分别为10079.5±1134.9、3436.5±34.5和220.5±16.8,实验组明显高于实验对照组(P<0.05)。实验组BGC-823细胞荧光素酶活性明显高于实验组SGC-7901(P<0.05)。　　 胃泌素孵育后,BGC-823细胞pGL4-Human-intron2组、pGL4-BGC-823-intron2组和pGL4组荧光素酶活性分别为217018.8±8999.7、18312.7±1691.2和(258.5±34.8),与孵育前无明显差异(P>0.05)；SGC-7901细胞pGL4-Human-intron2组、pGL4-SGC7901-intron2组和pGL4组荧光素酶活性分别为11036.7±1098.4、3526±194.2和262±27.7,与孵育前无明显差异(P>0.05)。　　 4.RegⅠ基因第2内含子的转录因子结合位点分析rVISTA软件分析,人白细胞、胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901 RegⅠ基因第2内含子均含有转录因子结合位点,其序列为GAGATAATAA。软件提示该序列可与转录因子PAX2、SMAD-Q6、AML1-Q6、CAP和NRSE-B结合。　　 结论：　　 1.RegⅠ基因第2内含子具有顺式调控功能。　　 2.RegⅠ基因第2内含子具有转录因子结合位点,其序列为GAGATAATAA。　　 3.胃泌素对RegⅠ基因第2内含子顺式调控功能无明显效应。