研究目的:本课题将一种特异性结合DEK蛋白的适配体DTA进行化学修饰以提高其体内稳定性,并通过体外细胞实验和体内动物实验考察修饰型靶向DEK适配体对类风湿性关节炎的治疗效果,以筛选出最佳新型靶向DEK适配体。研究方法:RNAStructure5.7软件模拟DTA最佳二级结构,并根据其二级结构特征拟在其脱氧核糖的2’位修饰甲氧基、3’端修饰反式脱氧胸苷和5’端修饰胆固醇。变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳考察修饰的靶向DEK适配体在DNase I、含2%BSA的RPMI 1640培养基及90%小鼠血清中的稳定性;生物膜干涉技术研究靶向DEK适配体与DEK蛋白间的结合动力学。CCK-8法检测靶向DEK适配体对单核巨噬细胞RAW264.7活性的影响;Percoll不连续密度梯度离心法从小鼠体内提取中性粒细胞;用LPS或PMA活化提取的中性粒细胞,并通过细胞免疫荧光实验和测定细胞外dsDNA含量考察靶向DEK适配体对中性粒细胞外陷阱(NETs)形成的影响;LPS刺激RAW264.7细胞建立炎症模型,通过免疫印迹法检测RAW264.7细胞刺激后DEK蛋白表达量变化,并用ELISA检测细胞上清中TNF-α浓度;细胞划痕实验检测靶向DEK适配体对人脐静脉内皮细胞HUVEC迁移能力的影响。最后,建立胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠模型,通过尾静脉注射靶向DEK适配体进行治疗;以CIA小鼠体重、脚掌厚度、临床评分、Micro-CT扫描、血清中TNF-α和IL-6含量、关节病理特征等为考察指标,评价靶向DEK适配体的体内抗炎活性及其治疗效果。研究结果:变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,在DNase I存在下、含2%BSA的RPMI 1640培养基及90%小鼠血清中,修饰后的靶向DEK适配体稳定性均有不同程度提高,其中DTA4(即在DTA全部脱氧核糖的2’位修饰甲氧基和3’末端修饰反式脱氧胸苷的适配体)的稳定性最好,其能在90%小鼠血清中稳定存在72 h。结合动力学结果显示,修饰和未修饰的靶向DEK适配体与DEK蛋白间的KD值在68.9～91.6 nM范围内,说明化学修饰对适配体与DEK蛋白间的亲和力影响较小。RAW264.7细胞毒性结果表明,靶向DEK适配体浓度低于100nM,除DTA1和DTA5外,其他靶向DEK适配体均未显示出明显的细胞毒性。细胞免疫荧光染色结果显示,各靶向DEK适配体均能在一定程度上抑制NETs的形成,使中性粒细胞网状结构减少,细胞膜趋于完整。DTA4的浓度为100 nM时,可显著抑制细胞外dsDNA的产生,dsDNA增长率低于4%。LPS刺激RAW264.7细胞可显著增加DEK蛋白表达量;DTA4浓度为100 nM时能够降低细胞分泌TNF-α,TNF-α的分泌与DEK蛋白表达量存在必然联系。DTA2和DTA4抑制细胞迁移的能力较为明显,可能通过抑制巨噬细胞DEK蛋白的表达而减弱HUVEC的迁移能力。药效学结果表明,与靶向DEK适配体DTA相比,DTA4和DTA6能明显降低临床评分值,减轻骨骼的侵蚀程度及病理进展,且DTA6较DTA4表现出更好的体内抗炎效果。实验结论:本课题基于特异性结合DEK蛋白的适配体DTA设计了六种修饰型靶向DEK适配体,其中DTA4和DTA6具有较好的抗炎效果,在炎症治疗领域有较好的应用潜力,为靶向适配体治疗类风湿性关节炎研究提供了新思路。