磁性二氧化硅载体的合成、表征及对酶的固定化

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固定化酶在化学生物学、生物工程、医学、环境工程及食品工业等学科领域的研究异常活跃。而固定化酶技术最为关键的是固定化酶载体的选择。与非磁性材料相比,磁性材料具有一些特殊的优点。本文合成了表面含有氨基和环氧基的两种磁性二氧化硅载体材料,并分别用这两种材料固定了胰蛋白酶和脂肪酶,同时对固定化酶的性质进行了研究。用化学沉淀法合成了磁性四氧化三铁纳米粒(MNP),粒径为27 nm左右。以MNP为核,用四乙氧基硅烷按改进的溶胶-凝胶法合成了核壳式磁性二氧化硅载体(MS)。以γ-氨丙基三乙氧基硅烷(γ-APTS)为硅烷偶联剂,在微量水存在下与MS反应,在MS表面修饰上氨基,合成了氨基修饰的磁性二氧化硅载体(AMS)。衰减全反射红外光谱显示AMS在2887 cm-1和2825 cm-1有两个吸收峰,-CH2-CH2-CH2-NH2的特征碳氢键伸缩振动吸收峰。XRD结果表明MNP、MS及AMS中的四氧化三铁均为磁铁矿型。用振动样品磁力计(VSM)表征其磁学性质,结果表明随四氧化三铁外包裹的二氧化硅层厚度的增加,饱和磁化强度(Mr)依次下降,分别为69.1、57.0、23.7 emu/g,同时这三种磁性载体的剩磁及矫顽力都较大,表明它们没有超顺磁性。用盐酸返滴定法测定了AMS表面氨基含量为0.1454 mmol/g。应用AMS固定化胰蛋白酶,研究了固定化的pH值,戊二醛的用量等反应条件对固定化酶的影响。结果显示在固定化反应缓冲溶液的pH为7.5,戊二醛的用量为1%时,固定化酶的效果最好。同时研究了AMS固定化胰蛋白酶的各种酶学性质,如最适反应pH值,固定化酶的热稳定性,重复操作性等,其中最适反应pH值比游离酶提高了0.5个pH单位;重复使用性较好,使用8次之后,剩余活性仍保持了初始活性的76%。表面修饰环氧基的磁性二氧化硅载体材料是一种新的固定化酶的载体材料。以MNP为核,以含有环氧基的3-[(2,3)环氧丙氧)]丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)为硅烷偶联剂,在pH=7.0的水溶液中,用氟离子作催化剂在减压条件下,合成了环氧基修饰的磁性二氧化硅载体(EMS)。对所合成的EMS作了以下表征:衰减全反射红外光谱显示在1255 cm-1、904 cm-1出现了环氧基的特征吸收峰。XRD表征EMS中的四氧化三铁也为磁铁矿型。振动样品磁力计(VSM)测定结果表明EMS的饱和磁化强度(Mr)为45 emu/g,但也没有超顺磁性。用改进的Na2S2O3滴定法测定了EMS中的环氧基的含量为0.1200 mmol/g。利用EMS固定化脂肪酶,研究了固定化的pH值及固定化温度对固定化脂肪酶的影响。固定化反应缓冲溶液的pH=8.0,固定化温度为25℃时固定化酶的效果最好。同时研究了EMS固定化脂肪酶的各种酶学性质,如最适反应pH值,固定化酶的热稳定性,重复操作性等。与游离酶相比,固定化酶的热稳定性有了较大提高,在60℃下仍保持了40%的相对活性;重复使用9次之后,剩余活性仍保持为初始活性的70%;固定化脂肪酶的最适反应pH值比游离脂肪酶提高了1个pH单位。为了进一步说明EMS在室温条件下可以通过打开环氧键与酶产生共价键合,本论文在25℃,pH 8.0的缓冲溶液中分别用三种载体MS、AMS、EMS固定化脂肪酶,比较了三种材料固定化脂肪酶的偶联效率,活力回收,相对活力。EMS固定化脂肪酶的偶联效率达到90%,活力回收达到60%,相对活力达到66%,三项指标均优于另外两种载体,EMS对脂肪酶的固定化效果最好。
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