背景脑胶质瘤是威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤之一,患者的病死率高,预后差。近年来脑胶质瘤的各种治疗手段,如手术,放疗,化疗等均无显著性进展,患者的生存期依然较短。快速增殖,较强的迁移/侵袭能力和降低的凋亡率是脑胶质瘤细胞的生长特点。凋亡信号调节激酶(ASK)家族分子可以诱导多种细胞的凋亡,ASK分子在脑胶质瘤中尚无研究报道,本课题主要研究ASK2在脑胶质瘤中的表达特征及预后价值,从体外细胞系水平和小鼠体内实验探究ASK2促进脑胶质瘤细胞增殖,迁移/侵袭能力的作用机制。第一部分ASK2在脑胶质瘤患者中的表达特征及临床参数分析目的探索ASK家族分子在脑胶质瘤肿瘤组织和非肿瘤组织中的表达差异以及在不同病理分级中的表达情况,分析ASK2基因水平和蛋白水平的表达特征,并评估其在脑胶质瘤患者中的预后价值。方法(1)分析GEO4290数据集和本院脑胶质瘤和脑外伤标本,对比肿瘤组织与非肿瘤正常组织中ASK家族基因的表达差异;(2)在GEO4290,CGGA和TCGA数据库以及本院脑胶质瘤患者中分析ASK2基因表达与胶质瘤WHO病理分级的相关性,分析ASK2基因表达在CGGA,TCGA和本院胶质瘤患者中的预后意义;(3)通过蛋白印迹和免疫组化检测本院脑胶质瘤患者中ASK2的表达,从蛋白水平进一步验证ASK2在不同WHO分级脑胶质瘤中的表达差异;分析ASK2蛋白表达水平与脑胶质瘤患者预后的相关性。结果(1)ASK2基因在GEO4290数据库和本院的胶质瘤患者的肿瘤组织中的表达显著高于非肿瘤组织;而ASK1和ASK3的基因表达在肿瘤组织和非肿瘤组织中无差异;(2)ASK2的基因表达与脑胶质瘤的病理分级呈正相关,ASK2基因在GBM中的表达水平显著高于WHO Ⅱ-Ⅲ胶质瘤;(3)蛋白印迹和免疫组化检测证实,ASK2蛋白水平表达与胶质瘤的病理分级呈正相关,ASK2在GBM中的蛋白表达显著高于WHO Ⅱ-Ⅲ胶质瘤;(4)在CGGA和TCGA数据库及本院患者中,ASK2基因高表达的脑胶质瘤患者预后更差;(5)免疫组化检测证实在本院胶质瘤患者中ASK2蛋白水平高表达者预后更差。结论ASK2基因在脑胶质瘤肿瘤组织中显著高表达;在GBM患者中ASK2基因水平和蛋白水平的表达均显著高于WHO Ⅱ-Ⅲ胶质瘤患者;ASK2高表达的脑胶质瘤患者预后更差。第二部分 探究ASK2对脑胶质瘤恶性生物学行为的影响目的通过体外细胞系实验,探索ASK2基因对脑胶质瘤U87和U251细胞系的增殖,迁移/侵袭和凋亡的影响。方法(1)探究通过siRNA抑制ASK2基因表达对脑胶质瘤U87和U251细胞系增殖,迁移/侵袭和凋亡的影响;(2)探究通过shRNA抑制ASK2基因表达对脑胶质瘤U87和U251细胞系增殖,迁移/侵袭和凋亡的影响;(3)设计携带人ASK2基因CDS区全长序列的质粒,经慢病毒包装,转染脑胶质瘤U87和U251细胞系,构建稳定过表达ASK2基因的胶质瘤细胞系;(4)在敲低或过表达ASK2基因的细胞系和相应对照组细胞系中,通过CCK8细胞增殖实验及细胞克隆形成实验检测细胞的增殖能力,通过流式细胞术用PI染色法检测细胞周期的分布;(5)利用细胞划痕实验和transwell细胞迁移实验检测抑制或提高ASK2基因表达对脑胶质瘤细胞系迁移能力的影响,通过transwell细胞侵袭实验检测ASK2基因表达的改变对脑胶质瘤细胞侵袭能力的影响;(6)应用流式细胞术通过Annexin-V和PI双染法检测抑制或提高ASK2基因表达对脑胶质瘤细胞系的凋亡的影响。结果(1)siRNA或shRNA敲低ASK2基因显著降低脑胶质瘤U87和U251细胞系在CCK8细胞增殖实验中450nm处的吸光度,降低细胞克隆形成数量和处于分裂期的细胞比例;(2)过表达ASK2基因明显增强U87和U251细胞系在CCK8细胞增殖实验中450nm处的吸光度,增加细胞克隆形成数量和处于分裂期的细胞比例;(3)利用siRNA,或shRNA敲低ASK2基因显著抑制U87和U251细胞的划痕愈合能力,减少transwell迁移和侵袭实验中到达下室的细胞数量;(4)过表达ASK2基因促进U87和U251细胞系的划痕愈合能力,增加transwell迁移和侵袭实验中到达下室的细胞数量;(5)siRNA或shRNA敲低ASK2基因,或过表达ASK2基因均不影响U87和U251细胞系的凋亡。结论抑制ASK2基因降低脑胶质瘤U87和U251细胞系的增殖,迁移和侵袭能力;过表达ASK2基因促进U87和U251细胞系的增殖,迁移和侵袭能力。抑制或增加ASK2的基因表达并不影响脑胶质瘤细胞系的凋亡。第三部分ASK2通过调控ERK-CDK1/MMP2/MMP9促进脑胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭目的探讨ASK2促进脑胶质瘤细胞增殖,迁移/侵袭的分子机制。方法(1)利用蛋白印迹实验检测抑制或过表达ASK2对其下游可能调控的分子ERK,p38和JNK的总蛋白和磷酸化蛋白水平的影响;(2)使用ERK抑制剂验证抑制ERK分子对过表达ASK2脑胶质瘤细胞系的CCK8增殖能力,transwell细胞迁移和侵袭能力的影响;(3)在CGGA和TCGA数据库中分析ASK2与CDK家族基因的相关性,筛选与ASK2基因呈显著正相关的CDK基因作为备选;经qPCR检测在敲低ASK2基因后降低最显著的CDK基因和过表达ASK2基因后升高最显著的CDK基因,进而得到与ASK2基因同步变化最显著的CDK1基因;(4)在CGGA和TCGA数据库中分析ASK2和MMP家族基因的相关性,初步筛选与ASK2基因呈显著正相关的MMP基因作为备选;通过qPCR检测在敲低ASK2基因U251细胞系中降低最显著的MMP基因和过表达ASK2基因后升高最显著的MMP基因,进而得到与ASK2基因同步变化最显著的MMP2/MMP9 基因;(5)利用蛋白印迹实验检测敲低或过表达ASK2基因对CDK1和MMP2,MMP9分子蛋白表达的影响;(6)在过表达ASK2的脑胶质瘤细胞系中使用ERK抑制剂,利用蛋白印迹实验检测ERK抑制剂是否可以抑制CDK1和MMP2,MMP9的蛋白表达;(7)检测CDK1抑制剂是否抑制ASK2基因过表达导致的胶质瘤细胞增殖能力的提高;检测MMP2/MMP9抑制剂是否抑制ASK2基因过表达导致的胶质瘤细胞的transwell细胞迁移和侵袭能力的增加。结果(1)敲低或过表达ASK2基因后,磷酸化ERK蛋白水平出现显著地降低或升高;而磷酸化p38和磷酸化JNK以及三者的总蛋白水平均无明显改变;(2)ERK抑制剂显著削弱ASK2基因过表达对脑胶质瘤细胞系增殖和迁移/侵袭能力的增强;(3)数据库筛选发现CDK1,CDK2,CDK6和CDK7的基因表达均与ASK2的基因表达呈显著地正相关,在敲低或过表达ASK2基因后对应降低或升高最显著的是CDK1;CDK1抑制剂显著降低过表达ASK2基因导致的脑胶质瘤细胞增殖能力的增强;(4)数据库筛选发现 MMP1,MMP2,MMP7,MMP9,MMP10,MMP11,MMP13和MMP14的基因表达均与ASK2基因表达呈显著地正相关,在敲低或过表达ASK2基因后对应降低或升高最显著的MMP分子是MMP2和MMP9;(5)ERK抑制剂显著降低ASK2过表达的脑胶质瘤细胞中CDK1和MMP2/MMP9的蛋白表达;(6)CDK1抑制剂显著降低过表达ASK2基因导致的脑胶质瘤细胞增殖能力的增强;MMP2/MMP9抑制剂显著降低过表达ASK2基因导致的脑胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的增加。结论ERK是ASK2下游信号转导的关键分子;ASK2-ERK-CDK1通路的活化促进脑胶质瘤细胞系的增殖;ASK2-ERK-MMP2/MMP9通路的活化促进脑胶质瘤细胞系的迁移和侵袭。第四部分体内动物实验验证ASK2促进脑胶质瘤的进展目的通过小鼠皮下成瘤实验探讨敲低或过表达ASK2基因对脑胶质瘤U87和U251细胞系体内成瘤能力的影响,以及在体内模型中验证磷酸化ERK,CDK1和MMP2/MMP9的蛋白表达与ASK2蛋白表达的关系。方法(1)将稳定敲低或过表达ASK2基因的脑胶质瘤细胞系与相应的对照组细胞系分别注射至小鼠皮下,构建小鼠皮下移植瘤模型,于不同时间点测量肿瘤大小和小鼠体重;(2)观察敲低或过表达ASK2基因对荷瘤小鼠生存期的影响;(3)对上述小鼠皮下成瘤的肿瘤组织进行免疫组化检测,探讨敲低或过表达ASK2基因在体内对磷酸化ERK,CDK1,Ki67和MMP2/MMP9蛋白表达的影响。结果(1)稳定敲低ASK2基因明显降低U87和U251细胞系皮下成瘤的大小,延长荷瘤小鼠的生存期;(2)稳定过表达ASK2基因显著增加U87和U251细胞系的皮下成瘤的肿瘤大小,缩短小鼠的生存期;(3)稳定敲低ASK2基因明显抑制U87和U251细胞系皮下移植瘤中磷酸化ERK,CDK1,Ki67,MMP2和MMP9的蛋白表达水平;(4)稳定过表达ASK2基因显著提高U87和U251细胞系皮下移植瘤中磷酸化ERK,CDK1,Ki67,MMP2和MMP9的蛋白表达水平。结论抑制ASK2基因表达显著降低脑胶质瘤U87和U251细胞系体内成瘤能力,延长小鼠的生存期;反之,过表达ASK2基因明显增加U87和U251细胞系体内成瘤能力,缩短小鼠的生存期。同时,从体内实验证实,ASK2通过调控下游ERK-CDK1,ERK-MMP2/MMP9通路促进脑胶质瘤细胞的进展。