论文部分内容阅读
目的:观察丹酚酸B（salvianolic acid B,Sal B）对血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）诱导体外培养SD大鼠新生乳鼠心肌成纤维细胞（cardiac fibroblast,CFs）-肌成纤维细胞转化（cardiac fibroblast-myofibroblast transformation,FMT）模型的干预作用,并探讨其可能的作用机制。方法:采用1-3天SD大鼠乳鼠通过胰酶消化法和差速贴壁法获取原代CFs。于倒置显微镜观察细胞形态。待其生长至90%融合后进行传代培养,实验选用2-3代细胞。采用抗波形蛋白（Vimentin）免疫细胞化学法鉴定CFs。采用NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC）进一步探讨Sal B对Ang Ⅱ诱导FMT与NF-κB活化的关系。采用溴化噻唑蓝四氮唑（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetra-zolium bromide,MTT）法观察Ang Ⅱ诱导CFs增殖的浓度效应和时间效应,以及Sal B对Ang Ⅱ诱导CFs增殖的抑制作用。Sal B对Ang Ⅱ诱导CFs增殖的抑制作用试验分为（Control,Ctrl.,无血清DMEM）、模型（Ang Ⅱ）组（1×10-66 mol/L）、Sal B低剂量组(Sal B（L）（12.5 umol/L Sal B+1×10-66 mol/L Ang Ⅱ）、Sal B中剂量组(Sal B（M）（25 umol/L Sal B+1×10-66 mol/L Ang Ⅱ）、Sal B高剂量组（Sal B（H））（50 umol/L Sal B+1×10-66 mol/L Ang Ⅱ）。划痕试验（Wound scratch assay）进行细胞迁移能力分析。Western blot分析I型胶原（collagen I,Coll I）、纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）、结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor,CTGF）、α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）、磷酸化的IκBα（p-IκBα）、IκBα、p-p65、p65、核p65、浆p65的表达。RT-PCR分析NF-κB mRNA的表达。采用消化法测定各组细胞培养上清液中羟脯氨酸含量。免疫荧光染色法观察α-SMA的表达。结果:倒置显微镜下观察到CFs呈扁平、梭形或多角形,排列紧密,有的交叉重叠生长,胞体较大,不具有自发搏动性。波形蛋白组细胞核为蓝色,胞质被染成棕黄色,符合心肌成纤维细胞的染色特征。抗波形蛋白免疫细胞化学染色阳性,鉴定我们所获得的细胞为CFs,纯度>99%。MTT结果显示,与Control组比较,Ang Ⅱ诱导CFs增殖（P<0.01）,Ang Ⅱ(1×10-6 mol/L)诱导CFs增殖为24 h与Ctrl.组相比（P<0.01）。与Ang Ⅱ组比较,Sal B（L）、Sal B（M）、Sal B（H）可抑制Ang Ⅱ所诱导的CFs增殖（P<0.05）。PDTC也可以抑制Ang Ⅱ诱导CFs增殖。划痕实验结果显示,与Control组比较,Ang Ⅱ组CFs的迁移能力明显提高（P<0.01）;与Ang Ⅱ组比较,Sal B（L）、Sal B（M）、Sal B（H）组能够明显抑制Ang Ⅱ诱导CFs的迁移能力（P<0.01）。Western Blotting实验结果显示:与Control组比较,Ang Ⅱ组中的Coll I、FN、CTGF的表达上调（P<0.01）,用Sal B预处理1h后,与Ang Ⅱ组相比,Sal B组能够抑制Coll I、FN和CTGF的表达（P<0.05）;与Control组比较,Ang Ⅱ组p-IκBα、p-p65表达上调（P<0.01）,IκBα和p65的表达没有明显影响。与Ang Ⅱ组比较,Sal B组中p-IκBα、p-p65的表达下调（P<0.05）,而IκBα和p65的表达没有明显影响。与Control组比较,Ang Ⅱ组p65易位入核。用Sal B预处理1h后,抑制了Ang Ⅱ诱导p65易位入核。与Control组比较,Ang Ⅱ组α-SMA表达上调（P<0.05）,Sal B（H）组、PDTC组以及Sal B（H）+PDTC组均抑制了Coll I和α-SMA的表达（P<0.05）。实时荧光定量PCR（RT-PCR）结果显示Ang Ⅱ可以诱导NF-κB mRNA表达增加（P<0.05）,与Ang Ⅱ组相比,Sal B组可以降低NF-κB mRNA表达（P<0.05）。羟脯氨酸含量测定结果显示Ang Ⅱ可以诱导胶原的分泌,羟脯氨酸含量升高（P<0.01）。与Ang Ⅱ组比较,Sal B（H）组、Sal B（H）+PDTC组以及PDTC组均能抑制羟脯氨酸含量升高（P<0.05）。免疫荧光染色结果显示,α-SMA被染成绿色荧光,核被DAPI染成蓝色,与Control组比较,Ang Ⅱ组中绿色荧光α-SMA表达增加;与Ang Ⅱ组相比,Sal B（H）组、Sal B（H）+PDTC组以及PDTC组均能抑制绿色荧光α-SMA的表达。结论:Sal B可以抑制Ang Ⅱ诱导的FMT,其机制与抑制NF-κB活化有关。