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生物素(vitamin H)是动物机体维持正常生理机能所必需的B族维生素之一,在畜牧业、食品及医药等领域应用广泛。我国所用的生物素大部分从美国、日本等国家进口,价格昂贵。因此,有必要进行生物素合成的研究。由于化学法生产的高污染性,利用微生物发酵生产生物素成为国际上高新技术竞争一大热点。枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌,细胞壁不含内毒素,能分泌大量蛋白到体外,作为一些重要工业酶制剂的生产菌种成为生产生物素的首选宿主菌。在生物素生物合成的研究过程中,发现大肠杆菌、沙雷氏菌、球形芽孢杆菌的生物素高产菌中,生物素合成酶基因(bioB)的高表达会引起宿主菌生长抑制,其蛋白表达存在表达量少、和不稳定等问题。关于枯草芽孢杆菌bioB基因的高表达尚无相关报道,为解决此问题,我们需要找出bioB基因低表达的原因,使生物素合成实现生物发酵以替代化学合成。本研究以枯草芽孢杆菌菌株为研究材料,利用强启动子PglvM和大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体构建枯草芽孢杆菌表达检测载体,该载体不仅可以检测出bioB低表达的原因,为生物素的合成奠定基础,还可以为今后的基因表达检测提供一个简易方便的工具。本试验以嗜热脂肪芽孢杆菌β-半乳糖苷酶编码基因(bgaB)为报告基因构建枯草芽孢杆菌表达检测载体。用ApaI和EcoRI双酶切质粒pBluskm-PglvM,得到启动子片段PglvM;用EcoRI和SacI双酶切质粒pDL获得报告基因bgaB;用ApaI和SacI消化大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pGJ103得到载体骨架;将以上三个片段用DNA连接酶连接得到表达检测载体pGJ324。测序结果表明,该载体从启动子PglvM开始依次为含SD序列的多克隆位点与含SD序列的bgaB基因。为了检测枯草芽孢杆菌表达检测载体pGJ324的表达效果,将无启动子的壮观霉素抗性基因(spec)克隆到pGJ324和pGJ103(无启动子)中得到spec基因表达检测载体pGJ324-spec和pGJ103-spec。将两个载体电转枯草芽孢杆菌1A747中得到重组菌pGJ324-spec(1A747)和pGJ103-spec(1A747),重组菌在含壮观霉素的固体LB培养基中培养36 h后,结果表明无启动子的壮观霉素抗性基因在PglvM的调控下成功表达,而pGJ103-spec(1A747)中的spec基因不能表达。另外,pGJ324-spec(1A747)的发酵液中检测到了β-半乳糖苷酶酶活,表明中bgaB基因也表达成功。pGJ324-spe(c1A747)中bgaB基因和spec基因的成功表达说明表达检测载体pGJ324构建成功。为了构建bioB基因表达检测载体,将基因bioB和bioI克隆到pGJ324中得到表达载体pGJ324-bioI和pGJ324-bioB。将两个载体转入1A747中进行表达,SDS-PAGE检测表明,pGJ324-bioI载体中的bgaB和bioI有明显条带,而bioB没有可见的蛋白条带,但是β-半乳糖苷酶的酶活测定表明pGJ324-bioB中的bgaB确实得到表达,说明处于bgaB上游位置的基因bioB成功转录。为进一步的研究,将约500 bp的bioB和bioI克隆到pGJ324的相应位点构建表达载体pGJ324- bioI500和pGJ324-bioB500,将载体质粒电转入1A747中进行表达,SDS-PAGE检测显示500 bp的基因片段被成功翻译成多肽,说明bioB和bioI的基因片段被成功翻译,β-半乳糖苷酶的酶活测定也显示融合表达载体上的bioI500,bioB500,bgaB被成功表达并且翻译。试验结果表明,枯草芽孢杆菌表达检测载体pGJ324构建成功;bioB可以被正常的转录和翻译,但是较低地蛋白表达原因仍需要进一步研究。