神经、内分泌、免疫三大系统相互联系,相互制约,构成复杂的神经内分泌免疫网络(NEI),在整体水平调节、维持机体的正常生理机能。内源性神经免疫调节肽α-黑素细胞刺激素(a-MSH)能够通过结合黑皮质素受体(MCRs)作用于免疫系统的不同细胞,或下调致炎因子的产生或抑制致炎因子的作用,产生抗炎和免疫调节效应；也可以通过结合中枢神经系统中表达的MCRs下行调控炎症反应。a-MSH在多种实验性炎症动物模型中已显示有明显的抗炎效应,但其作用机制尚未阐明。在细菌脂多糖(LPS)的致炎生物学效应中,IKK/IKB/NF-κB-(NF-κB)通路和Raf-1/MEK1-MEK2/ERK1-ERK2 (ERK)通路是其诱导单核巨噬细胞产生TNF-α的重要信号通路。在NF-κB通路中,IKK扮演了非常重要的角色,尽管上游信号路径不同,但是最终都汇集到IKK。其中,IKKβ亚基在催化IкB蛋白磷酸化以及调节经典、非经典NF-κB活化通路中发挥重要作用,IKKβ被认为是IKK复合酶体的一个重要亚基。在ERK通路中,激活的Raf-1能够继续活化其下游的丝裂素活化蛋白激酶激酶(MEK)、丝裂素活化蛋白激酶(MAPK),进一步激活下游转录调节因子,促进TNF-α的产生。ERK通路还能偶联NF-κB信号通路：当ERK通路下游的S6激酶(p90)被激活后,能够使IκBα的Tyr残基磷酸化降解,NF-κB被释放入核,促进TNF-α的产生。微小RNA (microRNA)是一类18-23个核苷酸组成的非编码蛋白质的单链小RNA分子,能够通过结合靶基因的mRNA而发挥转录后调节的功能。研究表明,microRNA影响着几乎所有的信号通路,参与多种生理病理过程,包括发育、分化、凋亡、脂肪代谢、病毒感染和癌症等。深入地研究microRNA的发生、作用机理和功能,将会揭示这些生物过程乃至一些疑难疾病的分子基础。尽管已有研究表明α-MSH能够通过调节PKA、P38激酶、IкBα等直接或间接地调控上述两条信号通路,从而抑制TNF-α等致炎因子的表达,发挥抗炎作用,但α-MSH是否通过影响microRNA的水平进而调控这两条信号通路的研究未见报道。因此,我们通过如下实验着重探讨了在LPS刺激下和加α-MSH处理后相关nicroRNA的变化及其调节IKKβ和Raf-1表达进而调控这两条信号通路的机制。第一部分α-MSH抑制THP-1细胞产生TNF-α的产生并上调hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的表达在第一部分实验中,我们采用人单核细胞系THP-1细胞,分别加入5×10-8mol/Lα-MSH、50 ng/ml LPS、5×10-8mol/Lα-MSH+50 ng/ml LPS刺激(即α-MSH组、LPS组和α-MSH+LPS组),另设未进行处理的对照组(control组),用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定TNF-α的分泌水平,用Real-Time qPCR检测TNF-αmRNA的相对表达量。ELISA结果显示：α-MSH+LPS组产生TNF-α的水平显著低于LPS组(P<0.01), Real-Time qPCR的结果也表明：α-MSH+LPS组TNF-α的mRNA表达量显著低于LPS组(P<0.01),说明α-MSH能够抑制LPS诱导的TNF-α产生。我们进一步通过targetscans、MiRBase等microRNAs靶标预测方法预测到hsa-miR-15b和hsa-miR-199a能够分别作用于Raf-1、IKKβ的3‘UTR区。为探明在THP-1中是否存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a以及α-MSH、LPS对这两种microRNAs的影响,同上所述设立control组、α-MSH组、LPS组和α-MSH+LPS组,采用Real-Time qPCR分别检测四组细胞中hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的相对表达量。结果显示：THP-1细胞中存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a;α-MSH能够上调二者的表达(与control组比较,P<0.01),LPS则抑制二者的表达(与control组比较,P<0.01)；同时, hsa-miR-15b和hsa-miR-199a在α-MSH+LPS组的相对表达量都显著高于LPS组(P<0.01),说明α-MSH能够促进hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的表达,拮抗LPS对二者表达的抑制作用。第二部分α-MSH抑制巨噬细胞产生TNF-α并上调hsa-mir-15b和hsa-mir-199a的表达上述结果表明在非正常人单核细胞(THP-1)来源的巨噬细胞中存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a,并且α-MSH和LPS均能影响二者的表达。在第二部分实验中,我们进一步研究了正常人外周血来源的单核巨噬细胞中是否也存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a,以及α-MSH、LPS对二者表达的影响。首先用不同浓度LPS(0、1、10、100、1000 ng/ml)作用于人单核巨噬细胞6 h,以确定LPS诱导TNF-a产生的量效关系；然后设立不同时间点(0、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h)检测LPS (20ng/ml)刺激细胞产生TNF-α的量,以明确时效关系。接着研究了不同浓度α-MSH (10-13、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8mol/L)对LPS (20ng/ml)诱导TNF-α产生的影响,以确定α-MSH的最佳浓度。ELISA结果显示：在不同浓度LPS刺激下,单核巨噬细胞产生TNF-α随LPS浓度的增加而增加,其中以1000 ng/ml LPS刺激作用最强,说明人单核巨噬细胞TNF-α的合成对LPS的刺激呈剂量依赖性；在LPS(20ng/ml)刺激45 min后开始产生TNF-α,在2 h-6 h内显著上升,8 h后TNF-α产生相对平缓,但仍能保持较高浓度；a-MSH (10-12mol/L)即可抑制LPS(20ng/ml)作用于人单核巨噬细胞2 h诱导的TNF-a的产生,其中a-MSH (10-8mol/L)的抑制效果最强。用Real-Time qPCR检测正常人外周血来源的单核巨噬细胞中hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的表达,观察a-MSH、LPS作用下随时间(15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h)不同二者的变化规律。结果显示：单核巨噬细胞中亦存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a; a-MSH组的hsa-miR-15b在15 min-8 h之间一直呈上升趋势,hsa-miR-199a在4 h时达到高峰后逐渐下降；LPS组的hsa-miR-15b和hsa-miR-199a则一直呈下降趋势；a-MSH+LPS组的hsa-miR-199a在加入LPS刺激4 h前一直呈上升趋势,在4 h后逐渐下降；hsa-miR-15b和hsa-miR-199a在a-MSH+LPS组中的变化趋势与其在a-MSH组中的变化趋势一致,但相对表达量低于a-MSH组。为探明a-MSH、LPS以及a-MSH+LPS刺激下hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的预测靶标Raf-1和IKKP的表达是否发生相应变化,我们采用Real-Time qPCR和Western blotting检测了细胞受不同刺激后Raf-1和IKKβ的mRNA和蛋白表达水平。Real-Time qPCR结果显示：a-MSH能够抑制Raf-1mRNA的表达(与control组比较,P<0.01),但对IKKβmRNA的表达无明显影响；LPS则上调Raf-1和IKKP mRNA的表达(与control组比较,P<0.01),同时,a-MSH+LPS组Raf-1 mRNA显著低于LPS组(P<0.05),说明a-MSH能够拮抗LPS对Raf-1 mRNA的上调,抑制其表达。Western blotting结果显示:a-MSH能够抑制Raf-1蛋白表达,但对IKKβ蛋白表达无影响；LPS则能够上调Raf-1和IKKβ蛋白的表达。上述结果表明：在正常人外周血来源的单核巨噬细胞中存在hsa-miR-199a和hsa-miR-15b; a-MSH和LPS在不同时间均能影响二者的表达；另外,a-MSH仅能下调Raf-1mRNA和蛋白的表达,对IKKβ无显著影响,LPS则能上调Raf-1、IKKβmRNA和蛋白的表达。第三部分Hsa-miR-15b和hsa-miR-199a靶标的验证和对LPS诱导巨噬细胞产生TNF-a的影响为进一步验证IKKβ、Raf-1是否分别为hsa-miR-199a和hsa-miR-15b的靶基因,我们先将hsa-miR-15b、hsa-miR-199a的mimics、mimics control、inhibitor、inhibitor control分别转染正常人外周血单核巨噬细胞,即为mimics组、mimics control组、inhibitor组、inhibitor control组。通过Western blotting检测Raf-1IKKβ的蛋白表达变化,通过Real-Time qPCR检测Raf-1、IKKβ的mRNA表达量。然后,将Raf-1和IKKβ的3’UTR区分别构建到荧光报告基因质粒载体,将hsa-miR-15b和Raf-13’UTR荧光报告基因质粒以及hsa-miR-199a和IKKβ的3’UTR荧光报告基因质粒分别共转入293T细胞,通过双荧光报告素酶检测系统检测hsa-miR-15b和hsa-miR-199a是否分别作用于Raf-1 3’UTR区和IKKβ的3’UTR区。Western blotting结果显示：hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的mimics能够分别抑制Raf-1和IKKβ的蛋白表达(与mimics control组比较), hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的inhibitor则分别促进Raf-1和IKKβ的蛋白表达(与inhibitor control组比较)；Real-Time qPCR结果显示：hsa-miR-15b的mimics能够抑制Raf-1的mRNA表达(hsa-miR-15b mimics与mimics control组比较,P<0.01)；hsa-miR-15b inhibitor则促进Raf-1 mRNA表达(hsa-miR-15b inhibitor与inhibitor control组比较,P<0.01),但hsa-miR-199a mimics和inhibitor对IKKβmRNA的影响并不明显,说明hsa-miR-199a仅抑制IKKβ的翻译,而不影响IKKβ的转录。双荧光报告素酶检测系统检测结果表明：hsa-miR-15b和hsa-miR-199a能够分别作用于Raf-1 3’UTR区和IKKβ的3’UTR区。上述结果表明：Raf-1和IKKβ分别是hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的靶标,并且,hsa-miR-15b能通过降低Raf-1的mRNA水平而抑制Raf-1的表达；hsa-miR-199a仅在翻译水平上抑制IKKβ。为进一步研究hsa-miR-15、hsa-miR-199a对LPS诱导的TNF-α的影响,我们将hsa-miR-15b、hsa-miR-199a的mimics、inhibitor分别转染人外周血单核巨噬细胞,实验分组：mimics control组、hsa-miR-15b mimics组、hsa-miR-199a mimics组、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a mimics组以及inhibitor control组、hsa-miR-15b inhibitor组、hsa-miR-199a inhibitor组、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a inhibitor组。然后加入LPS刺激4 h,ELISA检测上清TNF-α, Real-Time qPCR检测TNF-αmRNA。ELISA结果显示：hsa-miR-15b mimics组、hsa-miR-199a mimics组、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a mimics组的TNF-α分泌量均显著低于mimics control组(与mimics control比较,hsa-miR-15b mimics组P<0.05,hsa-miR-199a mimics组P<0.05, hsa-miR-15b+hsa-miR-199a mimics组P<0.01)；hsa-miR-15b inhibitor组、hsa-miR-199a inhibitor组、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a inhibitor组的TNF-α分泌量均显著高于inhibitor control组(与inhibitor control组比较,各组P<0.05)；Real-Time qPCR结果也表明:hsa-miR-15b mimics组、hsa-miR-199a mimics、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a组的TNF-αmRNA的表达量均显著低于mimics control组(与mimics control组比较,各组P<0.01),hsa-miR-15b inhibitor组、hsa-miR-199a inhibitor组、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a inhibitor组的TNF-αmRNA的表达量均显著高于inhibitor control组(与inhibitor control组比较,各组P<0.01),说明hsa-miR-15b、hsa-miR-199a能够抑制TNF-αmRNA和蛋白的表达。综上所述,通过本课题的研究发现,在THP-1细胞和正常人外周血来源的单核巨噬细胞中均存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a;α-MSH能够上调hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的表达,LPS则抑制二者的表达；α-MSH通过上调hsa-miR-15b抑制ERK通路中的关键组分Raf-1的表达,抑制LPS诱导的TNF-α产生；LPS则通过下调hsa-miR-15b和hsa-miR-199a,促进IKKP、Raf-1的表达,从而促进TNF-α的产生。本研究从microRNA调控层面初步揭示了α-MSH的抗炎作用机制,为探明神经内分泌免疫调节网络在疾病发生与防治中的作用供了新的思路,并为抗炎药物的筛选和研发提供了新靶标。