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随着科学技术的发展,人工授精技术(AI)目前已被广泛应用于牛的育种工作,所以得到高质量的精子非常重要。然而,冻融过程中大约有40-50%的精子失去活性,不利于良种公牛种用价值的充分发挥。目前对于精液冷冻保存的研究,大多涉及不同稀释液对精液冷冻质量的影响,探求适宜的冷冻稀释液配方。关于稀释液中不同成分提高精子活力的机理,影响精子冻后活力的相关基因、蛋白及其相互作用等研究的相对较少。哺乳动物细胞可以通过热应激蛋白(HSPs)的合成来抵抗环境压力,HSPs的表达与精子运动能力和生育能力有关,且精子蛋白质组学分析可以成为评价精子抗冻性的一个有效途径。本研究通过改良的热Trizol法对牛精子总RNA提取方法进行了初步探讨,通过实时荧光定量PCR检测了热应激蛋白70(HSP70)在精子冷冻各个时期(新鲜精液、平衡后、解冻后)的基因表达量,利用各种检测技术检测牛精子在各个时期的质量,分析精子质量与HSP70基因表达的相关性。获得以下主要研究结果：1.获得提取牛精子RNA的有效方法,精子数量与Trizol体积的最适搭配比例为3.75×107个/mL,二硫苏糖醇(DTT)能够替代β-巯基乙醇作为裂解精子的辅助剂。内参基因β-actin和目的基因HSP70在新鲜牛精子中都有基因表达。2.随着冷冻过程的进行HSP70基因表达量逐渐降低,且各时期的表达量有显著差异。新鲜精子的HSP70基因表达量(0.985)显著高于平衡后的精子(0.160)(P<0.05),平衡后的精子表达量又显著高于解冻后的精子(0.082)(P<0.05)。3.随冷冻过程的进行,牛精子的质量逐渐降低。活力高的精子HSP70基因表达量高,而活力低的精子HSP70基因表达量低。4.冷冻不同时期HSP70基因表达量与精子活力之间存在较强的正相关,其相关系数分别为0.630(新鲜精液)、0.785(平衡后精液)和0.327(解冻后精液)。